劉 謙，夏興洲，李金麗，王文真，李沖慧，王萬聰

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450000

臨床中，胃癌已成為常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。由于胃癌早期癥狀隱匿，加上我國內(nèi)窺鏡篩查率低等種種原因，導(dǎo)致多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期[2]，而且，雖然手術(shù)結(jié)合放化療的治療方式可大大提高早期胃癌患者的治愈率，但晚期胃癌患者預(yù)后較差[3]，因此，探究胃癌早期診斷及治療靶標(biāo)具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)為不編碼蛋白質(zhì)RNA，其長度超過200核苷酸[4]。既往研究顯示，lncRNA與胚胎發(fā)育、新陳代謝等存在相關(guān)性[5-7]。本課題組前期利用lncRNA表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胃癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)顯著升高。因此，本文進(jìn)一步探討了lncRNA EXOC7與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2016年1月至2018年6月收治的原發(fā)性胃癌患者134例，經(jīng)手術(shù)病理確診，均接受手術(shù)治療，且術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療。134例胃癌患者中，男73例，女61例，年齡(61.72±11.53)歲(37～74歲)；腫瘤位置：賁門26例，胃體43例，胃竇65例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期81例，Ⅳ期13例；分化程度：高分化22例，中分化28例，低分化84例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例；有深層浸潤者49例；有脈管癌栓者79例。另將同期在我院體檢的80名體檢正常者作為對(duì)照組，男47例，女33例，年齡(60.18±10.69)歲(35～72歲)。兩組一般資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：胃癌患者術(shù)中取癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣≥1 cm)作對(duì)照組織，樣本采集后立即經(jīng)液氮冷凍，并置于-80 ℃保存待用。所有癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)為正常胃組織。胃癌組和對(duì)照組均于清晨采集空腹外周靜脈血4 ml，室溫靜置30 min，1 500 r/min離心10 min，取上層血清于-80 ℃保存待檢，整個(gè)過程避免溶血。

1.2.2 試劑與儀器：RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR試劑盒由TaKaRa公司提供；lncRNA EXOC7引物由上海生工生物工程有限公司合成；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)儀購自ABI公司；Nanodrop分子檢測(cè)儀器購自Thermo Fisher公司。

1.2.3 檢測(cè)方法：取50 mg組織樣本經(jīng)超聲勻漿或1 ml血清，按RNA提取試劑盒步驟提取基因組RNA，使用Nanodrop分子檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度和質(zhì)量，當(dāng)RNA濃度>50 ng/μl，OD260/OD280值為1.8～2.1，認(rèn)為樣本質(zhì)量良好[8]。然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中500 nmol/L逆轉(zhuǎn)錄引物2 μl、模板RNA 1 μl、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μl、10 mmol/L dNTPs 2.5 μl、30 U/μl RNA酶抑制劑0.1 μl、10×RT buffer 1.5 μl，DEPC水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：20 ℃退火15 min，37 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃滅活5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存。qPCR反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μl、上游引物及下游引物各1 μl、SYBR Green Ⅱ Mix 10 μl，DEPC水補(bǔ)至20 μl。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT公式計(jì)算lncRNA EXOC7表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，每組取3個(gè)復(fù)孔均值，根據(jù)各樣本的平均Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因表達(dá)水平，lncRNA EXOC7相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt值(lncRNA EXOC7)-2-ΔΔCt值(β-actin)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)情況qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.24±1.86vs2.37±0.81，t=33.494，P=0.000)(見圖1)；胃癌患者血清中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.29±0.47vs0.92±0.23，t=74.553，P=0.000)(見圖2)。

2.2 癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置的患者胃癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但胃癌患者血清及癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7在不同臨床分期、浸潤深度、分化程度及有無脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即TNM分期越高、分化程度越低、浸潤深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓的患者，其胃癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平越高(見表1)。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平的比較；圖2 兩組血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平的比較

臨床病理特征例數(shù)癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)t/F值P值血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)t/F值P值性別 男738.29±1.240.246>0.054.35±0.420.371>0.05 女618.17±1.334.12±0.56年齡 <60歲568.34±1.750.794>0.054.34±0.930.690>0.05 ≥60歲788.16±1.654.18±0.65腫瘤直徑 ≥5 cm628.27±1.100.772>0.054.30±0.340.548>0.05 <5 cm728.21±1.254.16±0.35腫瘤位置 賁門268.34±1.190.214>0.054.25±0.420.609>0.05 胃體438.15±1.114.32±0.96 胃竇658.28±1.134.18±0.72TNM分期 Ⅰ期114.07±0.969.476<0.051.73±0.2913.378<0.05 Ⅱ期295.19±0.932.91±0.31 Ⅲ期818.93±1.824.75±0.46 Ⅳ期139.31±1.125.20±0.54分化程度 低849.62±2.5717.039<0.054.97±0.6711.248<0.05 中288.24±1.613.05±0.46 高227.05±1.761.82±0.34淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有618.42±1.6310.545<0.054.81±0.598.609<0.05 無738.07±0.874.12±0.64浸潤深度 ≤50%肌層857.16±1.946.626<0.053.97±0.537.197<0.05 >50%肌層498.79±2.705.03±0.82脈管癌栓 有798.58±1.169.132<0.054.88±0.438.114<0.05 無557.94±1.123.73±0.51

3 討論

臨床中，lncRNA主要表達(dá)于真核細(xì)胞中，其為一類不編碼蛋白質(zhì)RNA，長度超過200核苷酸，其具有豐富的生物學(xué)功能[8]。據(jù)報(bào)道，lncRNA可在基因組轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳學(xué)等層面上調(diào)控基因的表達(dá)[9-10]。臨床研究表明，lncRNA參與細(xì)胞增殖、分化及生物體發(fā)育、衰老等重要過程[11-12]。既往研究顯示，表達(dá)異常的lncRNA參與多種人體疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。最近的研究表明，lncRNA能夠與RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促癌或抑癌基因的功能[14-15]，此外，lncRNA還參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程[16-17]。

臨床研究表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)患者生命健康已造成嚴(yán)重威脅[18]。由于胃癌早期癥狀隱匿，加上我國內(nèi)窺鏡篩查率低等原因，導(dǎo)致多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，而且，盡管胃癌臨床治療措施不斷完善，但大多胃癌患者確診時(shí)已屬晚期，加上其臨床復(fù)發(fā)率高且易出現(xiàn)化療耐藥，往往患者預(yù)后不理想[19]，因此，尋找新的研究方向，進(jìn)一步探究胃癌早期診斷及治療靶標(biāo)具有重要意義，而近年來引起廣泛關(guān)注的lncRNA可能正是我們所要尋找的胃癌研究的突破口。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA在胃癌中均有表達(dá)[20]，但lncRNA與胃癌的關(guān)系尚不明確。

在本研究中，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，134例胃癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與基因芯片結(jié)果相一致；胃癌患者血清中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA EXOC7在胃癌患者血清及癌組織中呈高表達(dá)。通過進(jìn)一步分析lncRNA EXOC7的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置的患者胃癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胃癌患者血清及癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7在不同臨床分期、浸潤深度、分化程度及有無脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即TNM分期越高、分化程度越低、浸潤深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓，則患者胃癌組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)水平越高，這提示lncRNA EXOC7與胃癌的惡性程度呈正相關(guān)，過表達(dá)的lncRNA EXOC7可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，推測(cè)下調(diào)lncRNA EXOC7的表達(dá)可能成為臨床胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，lncRNA EXOC7在胃癌患者血清及癌組織中均呈高表達(dá)，其與胃癌惡性程度相關(guān)，可能成為胃癌早期診斷及病情判斷的潛在指標(biāo)。