姚競杰 申祥 徐萍 徐小博 王三虎

摘 要：為進(jìn)一步探明Foxl3的結(jié)構(gòu)、功能信息，及其在魚類性別決定和分化中的作用，利用生物信息學(xué)方法對歐洲黑鱸、青鳉、斑馬魚和虹鱒的Foxl3蛋白進(jìn)行同源性、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：歐洲黑鱸與青鳉、斑馬魚同源性較高，和虹鱒相似度不高，只有79%;魚類的Foxl3蛋白分別編碼269、264、260和296個(gè)氨基酸;該蛋白定位于細(xì)胞核，無明顯信號肽和跨膜結(jié)構(gòu);主要的二級結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，且α-螺旋所占百分比：虹鱒>青鳉>歐洲黑鱸>斑馬魚，無規(guī)則卷曲所占百分比：歐洲黑鱸>虹鱒>青鳉>斑馬魚;均包含1個(gè)Forkhead家族（FH superfamily）功能結(jié)構(gòu)域。

關(guān)鍵詞：Foxl3;魚類;性別決定與分化;生物信息學(xué)

中圖分類號 Q344文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）17-0016-03

魚類的性別決定機(jī)制具有原始性、多樣性和易變性，且存在雌雄同體到雌雄異體的各種性別類型，性逆轉(zhuǎn)在魚類中也是常見的現(xiàn)象。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于魚類的性別決定和分化相關(guān)基因的研究越來越多，主要基因有Sox9、Dmrt1、Dax1、Wt1、Sf1、Amh、Tra2、Foxl2和芳香化酶基因[1-2]。

Foxl2（Winged helix/forkhead transcription factor gene）屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族，是目前發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物卵巢決定和分化的最早的標(biāo)志性啟動(dòng)基因，它可以調(diào)節(jié)卵巢芳香化酶，對卵巢的分化起到重要作用。目前關(guān)于魚類Foxl2的研究，已經(jīng)在羅非魚[3]、石斑魚[4]、胡子鯰[5]、稀有鮈鯽[6]、烏鱧[7]、舌齒鱸、青鳉[8]、斑馬魚[9]、虹鱒[10]、牙鲆[11]和黃鱔[12]等展開。研究中發(fā)現(xiàn)Foxl2廣泛表達(dá)于腦、垂體、鰓和性腺中，主要作用機(jī)制為：激活CYP19a的表達(dá)和抑制精巢特異基因的表達(dá)，如Sox9、Dmrt1。

Forkhead基因家族進(jìn)化分析表明，F(xiàn)oxl2在許多硬骨魚類中存在不同的拷貝，即Foxl2存在旁系同源基因，分別命名為Foxl2a（Foxl2）和Foxl2b（Foxl3），它們在不同的硬骨魚類中被描述，并被認(rèn)為是魚類特異性存在。根據(jù)基因組進(jìn)化分析，真獸亞綱動(dòng)物在進(jìn)化過程中失去了Foxl3拷貝[13，14]，F(xiàn)oxl2已有很多研究且與卵巢的發(fā)育相關(guān)，那么Foxl3在低等脊椎動(dòng)物中的功能，尤其是與性別分化相關(guān)的功能需要深入研究[13]。

1 材料與方法

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax）、青鳉（Kryptolebias marmoratus）、斑馬魚（Danio rerio）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的foxl3蛋白序列，采用BLAST功能比對分析4種魚的foxl3蛋白序列同源性，利用Protparam程序?qū)?種魚foxl3蛋白序列的氨基酸進(jìn)行分析，應(yīng)用PSORTⅡ進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用SOPMA和SWISS對foxl3蛋白氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，通過TargetP 1.1和TMHMM Server v.2.0在線分析蛋白序列跨膜區(qū)域，采用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列來源及同源性 目前為止，GenBank中僅有歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax）、青鳉（Kryptolebias marmoratus）、斑馬魚（Danio rerio）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的foxl3蛋白序列。GenBank登錄號分別為：歐洲黑鱸：AFV13295，青鳉：APD78564，斑馬魚：AAI62838和虹鱒：NP_001117956。通過NCBI的BLAST功能比對分析4種魚的foxl3蛋白序列，結(jié)果顯示（圖1），歐洲黑鱸foxl3蛋白氨基酸序列與青鳉相似度100%，與虹鱒foxl3蛋白氨基酸序列相似度99%，相似度非常高;而與斑馬魚foxl3蛋白氨基酸序列相似度79%，相似度不是很高。

序列同源性分析

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用Protparam程序?qū)?種魚foxl3蛋白序列的氨基酸組成、等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)、摩爾消光系數(shù)等進(jìn)行在線分析。亞細(xì)胞定位應(yīng)用PSORTⅡ進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。由表1可見，歐洲黑鱸foxl3蛋白編碼269個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為29.925，理論等電點(diǎn)8.48，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核;青鳉foxl3蛋白編碼264個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為29.457，理論等電點(diǎn)7.71，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核;斑馬魚foxl3蛋白編碼260個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為29.306，理論等電點(diǎn)8.4，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核;虹鱒foxl3蛋白編碼296個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為33.221，理論等電點(diǎn)8.46，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。4種魚foxl3蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi)，最有可能具有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，這與foxl2蛋白功能相近。

2.2.2 二級結(jié)構(gòu) 利用SOPMA對4種魚foxl3蛋白氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，4種魚foxl3蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。歐洲黑鱸foxl3蛋白由15.99%α-螺旋，5.58%β-轉(zhuǎn)角，9.67%延伸鏈和68.77%無規(guī)則卷曲組成。青鳉foxl3蛋白由18.18%α-螺旋，6.44% β-轉(zhuǎn)角，11.74%延伸鏈和63.64%無規(guī)則卷曲組成。斑馬魚foxl3蛋白由15.77%α-螺旋，7.31%β-轉(zhuǎn)角，13.85%延伸鏈和63.08%無規(guī)則卷曲組成。虹鱒foxl3蛋白由20.27%α-螺旋，3.72%β-轉(zhuǎn)角，8.78%延伸鏈和67.23%無規(guī)則卷曲組成;4種氨基酸序列結(jié)構(gòu)基本一致（圖2）。

2.2.3 功能結(jié)構(gòu)域 4種魚的foxl3蛋白功能結(jié)構(gòu)域采用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測，結(jié)果顯示，歐洲黑鱸foxl3蛋白在第38～123個(gè)氨基酸區(qū)域、青鳉foxl3蛋白在第39～124個(gè)氨基酸區(qū)域、斑馬魚foxl3蛋白在第35～120個(gè)氨基酸區(qū)域和虹鱒foxl3蛋白在第54～139個(gè)氨基酸區(qū)域均為Forkhead家族（FH superfamily）結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.2.4 三維結(jié)構(gòu)及其功能預(yù)測 利用SWISS-MODLE軟件構(gòu)建4種魚foxl3蛋白三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，歐洲黑鱸、青鳉和斑馬魚的三維結(jié)構(gòu)基本一致，僅虹鱒的三維結(jié)構(gòu)與前3種魚存在細(xì)微的差異。三級結(jié)構(gòu)決定了蛋白的性質(zhì)，所以foxl3蛋白在4種魚性別分化過程中起作用。

3 討論

魚類性別分化不僅受遺傳因素控制，還受環(huán)境的影響，是多種因素綜合作用的結(jié)果。雌激素在硬骨魚卵巢分化中起決定性誘導(dǎo)作用，是卵巢分化的天然誘導(dǎo)劑，一旦性腺中有雌激素合成，無論其遺傳性別如何，都將發(fā)育為卵巢。青鳉性別決定基因的研究表明，通過抑制雌激素的合成或調(diào)控雌激素合成信號通路因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)性別控制，亦可通過基因敲除實(shí)現(xiàn)性別逆轉(zhuǎn)。此外，多年來雖然在魚類克隆得到了很多哺乳動(dòng)物性別決定的同源基因，但這些基因在魚類性別決定與分化中的真正功能和作用尚待深入研究。同時(shí)，由于硬骨魚類性別決定機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性，性別決定的分子機(jī)制總體尚不清楚。

本研究通過對Genbank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的Foxl3蛋白氨基酸序列（歐洲黑鱸、青鳉、斑馬魚和虹鱒）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)4種魚Foxl3蛋白氨基酸序列之間相似度較高;且蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi)，無跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和磷酸化位點(diǎn);二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，含有1個(gè)Forkhead家族結(jié)構(gòu)域。

參考文獻(xiàn)

[1]李永婧，吳利敏，李學(xué)軍. 硬骨魚類性別決定與分化相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，45（04）：72-78.

[2]文愛韻，尤鋒，徐永立，等.魚類性別決定與分化相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2008（01）：74-80.

[3]Ijiri S，Kaneko H，Wang DS，et al. Sexual dimorphic expression of genes in gonads during early differenation of a teleost fish，the Nile tilapia Oreochromis niloticus[J].Biology of Reproduction，2008，78：333-341.

[4]Alam M A，Kobayashi Y，Horiguchi R，et al. Molecular cloning and quantitative expression of sexually dimorphic markers Dmrt1 and Foxl2 during female-to-male sex change in Epinephelus merra[J]. General and Comparative Endocrinology，2008，157（1）：75-85.

[5]Sridevi P， Senthilkumaran B. Cloning and differential expression of FOXL2 during ovarian development and re-erudescence of the eatfish，Clarias gariepinus[J]. General and Comparative Endocrinology，2011，174：259-268.

[6]Wang H，Wu T，Qin F，et al. Molecular cloning of FOXL2 gene and the effects of endocrine-disrupting chemicals on its mRNA level in rare minnow，Gobiocypris rarus[J]. Fish physiology and biochemisty，2012，38（3）：653-664.

[7]Wang D，Zhang G，Wei K，et al. Molecular identification and expression of the FOXL2 gene during gonadal sex differentiation in northern snakehead Channa argus [J]. Fish physiology and biochemisty，2015，41：1419-1433.

[8]Nakamoto M，Matsuda M，Wang DS，et al. Molecular cloning and analysis of gonadal expression of Foxl2 in the medaka，Oryzias latipes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，344（1）：353-361.

[9]Jiang W，Yang Y，Zhao D，et al. Effects of sexual steroids on the expression of foxl2 in Gobiocypris rarus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2011，160（4）：187-193.

[10]Xu G，Huang T，Jin X，et al. Morphology，sex steroid level and gene expression analysis in gonadal sex reversal of triploid female（XXX）rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）[J]. Fish Physiol Biochem，2015：1-10.

[11]Si Y，Ding Y，He F，et al. DNA methylation level of cyp19a1a and Foxl2 gene related to their expression patterns and reproduction traits during ovary development stages of Japanese flounder（Paralichthys olivaceus）[J]. Gene，2015，575：321-330.

[12]Hu Q，Guo W，Gao Y，et al. Molecular cloning and analysis of gonadal expression of Foxl2 in the rice-field eel Monopterus alus[J]. Sci Rep-UK，2014，4：6884.

[13]Geraldo MT，Valente GT，Braz AS，et al. The discovery of Foxl2 paralogs in chondrichthyan，coelacanth and tetrapod genomes reveals an ancient duplication in vertebrates[J]. Heredity，2013，111：57-65.

[14]Crespo B，Lan-Chow-Wing O，Rocha A，et al. foxl2 and foxl3 are two ancient paralogs that remain fully functional in teleosts[J]. General and Comparative Endocrinology，2013，194：81-93.

（責(zé)編：楊 林）