饒 榕 ， 丁彥蕊

（1.江南大學 物聯網工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 數字媒體學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

木聚糖酶能夠將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖，是造紙、醫(yī)藥、飼料以及食品等領域常用的酶制劑。耐熱木聚糖酶因其能在高溫下保持活性而在工業(yè)生產中有廣泛的應用。多年來，人們通過序列比對、結構分析、定點突變以及分子模擬等方法研究木聚糖酶的耐熱性[1]。目前一些研究表明：鹽橋是穩(wěn)定木聚糖酶結構的主要作用力[2]；芳香族氨基酸的疏水作用增加了結構內部的穩(wěn)定性[3]；N端結構的穩(wěn)定[4]、二硫鍵數目增加[5]以及表面精氨酸含量的增加[6]對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性也至關重要；隨著研究的深入，人們又發(fā)現木聚糖酶結構中存在熱穩(wěn)定區(qū)[7-8]，這充分表明了木聚糖酶序列和結構因素之間通過協同作用來提高熱穩(wěn)定性[9]。

將蛋白質編碼為氨基酸網絡，從系統(tǒng)角度分析影響蛋白質耐熱性的各因素之間的關系，是闡明蛋白質耐熱機制的有效方法。作者構建了不同類型的Fe-SOD酶的氨基酸-氨基酸相互作用網絡并研究網絡中的hub節(jié)點，發(fā)現耐熱Fe-SOD酶中hub是疏水的甘氨酸和亮氨酸，這些殘基形成較強的疏水核心，提高了Fe-SOD酶的結構穩(wěn)定性[10]。另外，還發(fā)現耐熱的Fe-SOD酶的平均度、平均連接強度等網絡參數要高于常溫的Fe-SOD酶[11]。Srivastava等通過結合復雜網絡理論和動態(tài)研究方法找到了對枯草芽孢桿菌脂肪酶耐熱性影響的重要殘基[12]。Brinda等人也通過網絡的方法發(fā)現了耐熱蛋白質網絡與耐溫蛋白質網絡之間的差異[13]。

水合作用協助蛋白質內部的共價及非共價相互作用維系了蛋白質結構的穩(wěn)定[14-17]。水分子-蛋白質的相互作用還影響著蛋白質的熱穩(wěn)定性[18]。耐熱蛋白質表面往往分布著豐富的帶電荷殘基，這些殘基除了容易形成鹽橋以穩(wěn)定結構外，還容易與水分子形成氫鍵以保護蛋白質的結構[19]。作者研究了耐熱性不同的Fe-SOD酶與水的相互關系，發(fā)現嗜熱Fe-SOD酶能與水形成更多的氫鍵，蛋白質與水以及水與水之間形成了氫鍵網絡來包裹蛋白質[20]。Sterpone等人通過分子動力學模擬研究了不同溫度下水對熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現對于嗜熱蛋白質，水能提高蛋白質內部的靈活性和結構的魯棒性[16]。此外，在耐熱蛋白質表面有大量親水性氨基酸與水接觸，還有大量鹽橋網絡在蛋白質-水界面上，帶電氨基酸在蛋白質-水界面的分布對熱穩(wěn)定性起到了重要作用。同時發(fā)現在高溫環(huán)境下蛋白質內部的氫鍵隨著溫度的上升而下降，而嗜熱蛋白質會通過與水接觸來補償[17]。Oleinikova通過研究水分子與氨基酸之間的氫鍵能量，發(fā)現在307 K時（這個溫度下生物體的生物活性最大），水與蛋白質表面形成的水化層對于能量是非常敏感的，而某些多肽結構是不敏感的，不敏感的多肽結構表明，熱穩(wěn)定性是由水與多肽合作形成水化的肽鏈來影響的。從而發(fā)現水對熱穩(wěn)定性的作用[21]。

作者通過Voronoi算法[22]識別出與木聚糖酶的氨基酸殘基相互作用的水，然后確定殘基與水之間的相互作用以及殘基-殘基之間的相互作用。以氨基酸殘基和水為節(jié)點，殘基與殘基、以及殘基與水之間的相互作用為邊構建無加權氨基酸殘基-水相互作用網絡。接下來，通過計算比較木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網絡的網絡拓撲特征來研究水對木聚糖酶耐熱性的影響。另外，以hub水為中心進行聚類，確定連接到該hub水的超過某一特定閾值的氨基酸殘基，并進一步分析子網的特性以及水與氨基酸殘基之間的關系，將利用殘基-水相互作用網絡確定水分子與木聚糖酶的耐熱性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 數據集及分子動力學模擬

以來自Thermoascus aurantiacus（T.aurantiacus，簡寫為T.aur）的耐熱木聚糖酶和來自Streptomyces lividans（S.lividans，簡寫為S.liv）的常溫木聚糖酶為研究對象。首先利用分子動力學模擬獲得它們在300、325、350、375 K下的構象。分子動力學模擬是在CHARMM27力場下，在含有8 841個水分子的水盒子中進行實驗的[9]。在每個溫度下得到300 ns軌跡數據，獲得了所有原子的坐標信息。每隔1 ns保存一個構象信息，這樣每個溫度下按照模擬時間順序保存了300個三維結構。

1.2 識別與木聚糖酶相互作用的水分子的Voronoi算法描述

Voronoi圖是由一組連接兩個相鄰的點的直線的垂直平分線組成的連續(xù)多邊形。由于要識別與氨基酸殘基有相互作用的水，首先將氨基酸殘基和水都看作節(jié)點，然后對氨基酸殘基節(jié)點按照最鄰近原則劃分平面，為每個氨基酸殘基節(jié)點分配一個區(qū)域（稱為Voronoi細胞）。然后根據水的三維坐標信息，篩選出在氨基酸殘基區(qū)域中的水分子。采用Voronoi算法分析木聚糖酶中的氨基酸殘基與水之間的關系，準確的給所有的氨基酸殘基節(jié)點分配空間，通過篩選區(qū)域中的水來識別與殘基相互作用的水分子。

具體算法描述如下：隨機選定一個氨基酸殘基節(jié)點，計算其最鄰近的兩個氨基酸殘基節(jié)點，三者組成一個Delaunay三角形。遍歷所有的氨基酸殘基節(jié)點，做出每個氨基酸殘基節(jié)點的Delaunay三角形。每個Delaunay三角形內部不包含任何氨基酸殘基節(jié)點；分別做出每個Delaunay三角形三條邊的垂直平分線，并計算出它們的中心；連接所有三角形中心，這些連線就構成了Voronoi多邊形。相應氨基酸殘基節(jié)點就是Voronoi多邊形的中心。保存每個Voronoi多邊形信息；對于每個Voronoi多邊形，統(tǒng)計多邊形區(qū)域內部的水分子，即為與該多邊形中心的氨基酸殘基存在相互作用的水分子。

上述算法中，Delaunay三角形是由與Voronoi多邊形共享一條邊的相關點連接而成的三角形，每個Voronoi多邊形對應一個氨基酸殘基節(jié)點。相比于常用的基于距離篩選水的方法，Voronoi算法能夠確定那些與氨基酸殘基距離較遠卻存在相互作用的水分子，數據更可靠。

1.3 構建殘基-水相互作用無加權網絡

計算氨基酸殘基a與氨基酸殘基b（a≠b）的重原子之間的距離，當距離在6.5×10-4m以內時，認為氨基酸殘基a與氨基酸殘基b之間存在相互作用[23]。氨基酸殘基與水之間的相互作用根據上述Voronoi算法確定。以氨基酸殘基和水為節(jié)點，殘基與殘基、以及殘基與水的相互作用為邊構建網絡。

1.4 網絡拓撲參數的計算

計算了平均度（degree）、平均無加權聚類系數（clustering coefficient）、平均接近中心性（closeness centrality）、平均節(jié)點中心性（Residue centrality）這些網絡拓撲參數。具體計算公式如下：

網絡平均度：

其中，ki為節(jié)點i的度代表節(jié)點i與j之間的邊，若有邊為1，無邊為0。N為網絡中的水節(jié)點數目。

聚類系數C[24]：

其中，ei為節(jié)點i的鄰居節(jié)點之間的實際邊數，ki為節(jié)點i的度。

節(jié)點水的平均接近中心性CC[24]：

水的節(jié)點中心性ΔLk：

1.5 基于hub水的殘基-水相互作用網絡聚類

網絡中節(jié)點之間往往會形成簇來共同完成某項功能。在木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網絡中，水分子與哪些氨基酸殘基或者水分子形成簇以及水分子如何影響殘基-殘基相互作用，需要對網絡進行聚類分析獲得。以hub水為聚類中心，設置閾值，獲得該水分子的簇。

其算法描述如下：

計算氨基酸殘基-水相互作用網絡中所有節(jié)點的度，將度為2的水設定為hub水；將hub水放在隊列H中，從隊列的第一個節(jié)點（第一個水）開始，找出與第一個水相連接的殘基，如果殘基的度大于等于設定的閾值K（K=18）時，將該殘基放入子網中；以此殘基為中心，遍歷其所有鄰居氨基酸殘基，如果鄰居殘基的度大于閾值K，那么就將該鄰居殘基放入子網中；重復步驟3，直到遍歷網絡中所有的殘基為止。在該子網中，重新回溯整個網絡，將網絡中原先與殘基相連接的水加入到子網中。重復步驟2～4，找出已知隊列中所有hub水的子網。

2 結果與討論

2.1 木聚糖酶中與氨基酸殘基相互作用的水分子分布

如方法部分所述，每個模擬溫度下的木聚糖酶的構象有300個，根據每個構象的原子坐標信息，利用Voronoi算法識別出了與氨基酸殘基存在相互作用的水分子。統(tǒng)計不同模擬溫度下水分子數在300個構象中的占比，然后比較不同耐熱性的木聚糖酶中水分子比例可以確定水分子數與耐熱性的關系，結果見圖1。

對于耐熱木聚糖酶以及常溫木聚糖酶，與氨基酸殘基相互作用的水分子數會隨著溫度的上升而減少，特別是350 K到375 K過程中，常溫木聚糖酶中水分子的數量急劇減少，這說明高溫減弱了常溫木聚糖酶中水分子與殘基之間的相互作用[21]。而對于耐熱木聚糖酶和常溫木聚糖酶在同一個溫度下比較時，發(fā)現嗜熱木聚糖酶中水分子的數量比常溫木聚糖酶中要多，并且隨著溫度升高，水分子的數量差異也越明顯?？梢姡葻崮揪厶敲钢邪被釟埢c水分子相互作用比常溫木聚糖酶更密切，嗜熱木聚糖酶中的氨基酸與水形成更多的氫鍵來抵御高溫[21]。

圖1 與耐熱和常溫木聚糖酶存在相互作用的水分子在不同模擬溫度下的分布Fig.1 Distribution of waters interacting with residues of thermostable and mesophilic xylanase at different simulated temperatures

2.2 木聚糖酶中hub水分子的數量隨模擬時間和溫度的變化

由于水的化學特性決定了與蛋白質相互作用的水分子最多能形成兩個氫鍵，因此將網絡中度為2的水看作是hub水，相對于度為1的水，它對蛋白質的影響更為重要。圖2表明，隨著溫度的升高，耐熱木聚糖酶和常溫木聚糖酶中hub水分子的數量不斷降低。但是對于某一特定溫度，嗜熱木聚糖酶中hub水分子數量遠遠高于常溫木聚糖酶，同時發(fā)現度為2的hub水分子數量在50 ns之后隨著時間的變化保持不變，說明雖然分子間是不停運動的，但是有一些氨基酸殘基始終與水發(fā)生相互作用，并保持緊密聯系[17]。

圖2 氨基酸-水相互作用網絡中hub水分子數量隨模擬時間和溫度的變化趨勢Fig.2 Trend of hub water number over time and temperature in residue-water interaction network

2.3 木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網絡中水的網絡特性

圖3 分別是從4個網絡參數的角度分析水在網絡中的參與程度。對于平均度（圖3（a）），平均聚類系數（圖 3（b）），平均接近中心性（圖 3（c）），平均節(jié)點中心性（圖3（d）），從圖中可以看出，在同一溫度下，嗜熱木聚糖酶中水分子的網絡參數比常溫木聚糖酶中水分子的網絡參數要高，說明這些網絡屬性與木聚糖酶熱穩(wěn)定性之間存在正相關關系。平均度、平均聚類系數、平均接近中心性、平均節(jié)點中心性分別從與氨基酸殘基的連接程度、鄰居節(jié)點的聚集程度、與殘基接近的程度、以及水分子如何從全局影響整個網絡這4個角度反映水分子在整個網絡中的貢獻以及參與程度。在300 K和325 K下，嗜熱木聚糖酶中水分子的平均度以及平均接近中心性都有顯著增加，而常溫木聚糖酶的這些網絡參數卻在減少。這些現象表明，隨著溫度升高，與常溫木聚糖酶相比，嗜熱木聚糖酶中某些氨基酸殘基與水形成更多的氫鍵，通過水合作用形成水化的肽鏈來穩(wěn)定蛋白質的結構[21]。在325 K時，耐熱木聚糖酶中水分子的網絡參數和常溫木聚糖酶的差異尤為明顯，耐熱木聚糖酶中水分子的網絡參數要比常溫木聚糖酶高很多。這表明水分子不僅能和嗜熱木聚糖酶中的氨基酸殘基形成氫鍵來穩(wěn)定蛋白質結構，還可以促進蛋白質內部氨基酸殘基的相互作用，提高蛋白質內部的靈活性和魯棒性[16]。 在其他溫度下，水分子在嗜熱木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網絡的貢獻也比在常溫木聚糖酶大，它們與殘基之間的作用也更加緊密[20]。

圖3 木聚糖酶氨基酸-水相互作用網絡中水的拓撲參數Fig.3 Distribution of topology parameters of water in residue-water interaction network of xylanase

2.4 子網規(guī)模變化趨勢

在氨基酸殘基-水相互作用網絡中，水的化學特性決定了其與蛋白質相互作用時最多能形成兩個氫鍵，因此將度為2的水看作hub水。相對于度為1的水，hub水對蛋白質的影響更為重要。在以hub水為中心的聚類過程中，發(fā)現hub水的數量并沒有影響到聚類后子網的個數。無論是嗜熱木聚糖酶還是常溫木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網絡，大部分hub水聚在同一個子網中，這說明hub水傾向于連接到那些度較高的氨基酸殘基節(jié)點上，即木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網絡存在“富人俱樂部”現象[25]。圖4是隨著時間和溫度的變化，子網大小的變化情況。表明了在300 K和375 K時，耐熱木聚糖酶的子網規(guī)模與常溫木聚糖酶的子網規(guī)模之間差距較為明顯。而在325 K和350 K時，子網規(guī)模相似。但是總體來說子網大小是隨著溫度升高而減小的。同時，耐熱木聚糖酶在300 K和325 K時子網減小的幅度要比常溫木聚糖酶小的多。

圖4 聚類后子網規(guī)模隨著模擬時間和溫度的變化趨勢Fig.4 Change trend of sub-network scale with simulation time and temperature after modularized network

2.5 水在子網中所占比例的變化趨勢

在圖5中，水在子網中的比例也表現出相同的變化趨勢，隨著溫度升高，水在網絡中占得比例減小。但是在同一溫度下，耐熱木聚糖酶中水的比例比常溫木聚糖酶要高很多。雖然木聚糖酶中的hub水都能連接到度較大的氨基酸殘基節(jié)點，但是在300、350、375 K情況下，通過圖4可以發(fā)現，常溫木聚糖酶中的子網規(guī)模要比嗜熱木聚糖酶中的子網更大一些，但是水在網絡中的比例卻小很多。隨著溫度升高，氨基酸殘基與氨基酸殘基之間的作用力會減弱，部分氫鍵會斷開，耐熱木聚糖酶可以與水形成更多的作用力來補償，幫助穩(wěn)定整個蛋白質的結構[17-18]，但對于常溫木聚糖酶卻不能表現出同樣的行為?？梢姡c氨基酸殘基之間的作用力對維持蛋白質的熱穩(wěn)定性有很大的作用[14]。

圖5 子網中水所占比例隨著模擬時間和溫度的變化趨勢Fig.5 Change trend of proportion of water in the subnetwork with simulation time and temperature

3 結語

分析了氨基酸殘基-水相互作用網絡中水的網絡參數，發(fā)現水對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響與網絡參數之間有正相關關系。還發(fā)現水與氨基酸殘基的作用會影響木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。用氨基酸殘基-水相互作用網絡表示蛋白質與水的結構，并用一些復雜網絡理論來研究水與氨基酸殘基之間的作用，以及水如何影響殘基-殘基的相互作用，可以為研究其他類型的蛋白質的耐熱性提供一個有效的思路。