李慧 王秉林 楊修成 王超 馬忠輝

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）轉(zhuǎn)流過程中應(yīng)用的血液稀釋、非搏動性灌注等獨特因素會引發(fā)大量炎性因子釋放誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其中大量炎性因子釋放并在肺內(nèi)堆積導(dǎo)致肺泡、肺間質(zhì)、肺毛細血管功能障礙，從而出現(xiàn)CPB 導(dǎo)致的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。CPB 誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的機制涉及多個方面，包括補體系統(tǒng)激活、中性粒細胞聚集、白細胞趨化、內(nèi)毒素釋放、血小板聚集等各項病理生理改變。

鹽酸戊乙奎醚是中國自主研制的新型抗膽堿類藥物，能夠通過選擇性阻斷M1、M3、N1、N2 受體，降低毛細血管壁的通透性，減少炎性因子滲出，穩(wěn)定溶酶體等亞細胞器細胞膜結(jié)構(gòu)，抑制休克因子釋放進而表現(xiàn)出細胞保護作用[2～4]。

體外循環(huán)過程存在體液、血液稀釋、血漿滲透壓波動等多重復(fù)合的特殊病理變化。選取何種處理方式以發(fā)揮鹽酸戊乙奎醚在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流期間最大的藥物效能，目前仍未有明確論斷。本研究通過制備體外循環(huán)下急性肺損傷大鼠模型[5]，應(yīng)用臨床中常見的預(yù)處理、后處理、預(yù)處理聯(lián)合后處理的方式對急性肺損傷動物模型進行干預(yù)。觀察鹽酸戊乙奎醚在不同處理方式下，急性肺損傷動物模型通氣指標、炎性因子及抗炎因子水平的波動，比較其保護作用的強弱。為臨床應(yīng)用鹽酸戊乙奎醚治療和預(yù)防體外循環(huán)導(dǎo)致的急性肺損傷提供動物實驗數(shù)據(jù)及藥物應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選擇350～500g 成年健康SD 大鼠50 只，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，許可證：ZZSYXK（豫）2017-00330。采用隨機數(shù)字表法將其分為5 組（n=10）：空白對照組（Shame 組）、體外循環(huán)組（CPB 組）、預(yù)處理組（Pre-PHC 組）、后處理組（Post-PHC 組）和聯(lián)合處理組（Comb-PHC 組）。Shame 組只插管、開胸，不做其他處理；CPB 組建立體外循環(huán)后結(jié)扎左肺門制造急性肺損傷模型，給藥時給予同等量生理鹽水；Pre-PHC 組于體外循環(huán)轉(zhuǎn)機前20min 給予PHC 2mg/kg；Post-PHC 組于左肺門開放后即給予PHC 2mg/kg；Comb-PHC 組則以PHC 2mg/kg 的總量于體外循環(huán)前20min 和左肺門開放后分別給予1mg/kg。

1.2 體外循環(huán)模型建立 各組大鼠應(yīng)用20%烏拉坦6ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥固定于動物手術(shù)臺，沿頸部正中切開分離左側(cè)頸動脈、右側(cè)頸外靜脈套帶備用，沿左側(cè)腹股溝縱行切開分離股動、靜脈套帶備用。采用自制帶側(cè)孔的套管針自頸外靜脈穿刺送入右心房水平進行靜脈引流；由左側(cè)頸動脈穿刺置入24G 留置套管針用于動脈灌注。左側(cè)股動脈穿刺置入連續(xù)動脈壓力監(jiān)測，股靜脈接入連續(xù)靜脈壓力監(jiān)測及微量輸液泵用于靜脈給藥。全身肝素化，待激活全血凝固時間（Activated Clotting time of whole blood，ACT）大于480s 后轉(zhuǎn)機進行體外循環(huán)，待血流循環(huán)穩(wěn)定后經(jīng)左側(cè)第4 肋間進胸仔細分離并夾閉左側(cè)肺門。阻斷60min 后開放左肺門，開始并行循環(huán)及雙肺通氣30min，待循環(huán)、尿量穩(wěn)定后停止CPB。CPB 停機前經(jīng)股動脈給予魚精蛋白中和肝素；拔除CPB 管道回收機血并經(jīng)外周尾靜脈回輸，魚精蛋白中和順利、循環(huán)穩(wěn)定30min 后結(jié)束手術(shù)。體外循環(huán)轉(zhuǎn)機過程中根據(jù)血氣結(jié)果維持電解質(zhì)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，根據(jù)平均動脈壓及中心靜脈壓調(diào)節(jié)液體量及血管活性藥物劑量。CPB 轉(zhuǎn)流期間維持動脈平均壓在60～70mmHg，轉(zhuǎn)機流量維持在35～40ml·kg-1·min-1，肛溫維持在32℃～34℃。術(shù)中應(yīng)用舒芬太尼、氯胺酮和維庫溴銨微量泵入維持麻醉深度。

1.3 觀察指標與檢測 各組大鼠分別于CPB 開始前30min（T1）、開放左肺門時（T2）、CPB 結(jié)束1h（T3）、CPB 結(jié)束4h（T4）抽取股動脈處血樣2ml，用于檢測血氣。記錄血氣中PaO2、A-aDO2水平，計算氧合指數(shù)（oxygenation index，OI）、呼吸指數(shù)（respiratory index，RI）。用酶聯(lián)免疫吸附定量測定法（ELISA）測定血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）含量。并用Taylor 公式校正CPB 稀釋血液因素對檢測值的影響。校正公式為：校正值=（術(shù)前HCT/采樣HCT）×實測值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間呼吸性指標比較 與Shame組相比，CPB、Pre-PHC、Post-PHC、Comb-PHC 組大鼠在T2～T4時間點OI 水平均下降，RI 水平均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pre-PHC、Comb-PHC組大鼠在T2～T4時間點OI 水平均高于CPB 組，RI 水平低于CPB 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Post-PHC 組在T3～T4時間點OI 水平均高于CPB 組，RI 水平低于CPB 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Comb-PHC 組在T3、T4時間點OI 水平均高于Pre-PHC 組，RI 水平均低于Pre-PHC 組；Post-PHC、Comb-PHC 組在T2時間點OI 水平低于Pre-PHC 組，RI 水平高于Pre-PHC 組；與Post-PHC 組相比，Comb-PHC 組在T2～T4時間點OI 水平高于Post-PHC 組，RI 水平低于Post-PHC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠不同時間點TNF-α、IL-6、IL-10 水平的比較 與Shame 組相比，CPB、Pre-PHC、Post-PHC、Comb-PHC 組大鼠在T2～T4時間點TNF-α、IL-6、IL-10 均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pre-PHC、Comb-PHC 組大鼠在T2～T4時間點TNF-α、IL-6 均低于CPB 組，IL-10 均高于CPB組；Post-PHC 組在T3～T4時間點TNF-α、IL-6 均低于CPB 組，IL-10 均高于CPB 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Post-PHC、Comb-PHC 組 在T2時 間點TNF-α、IL-6 高于Pre-PHC 組，IL-10 低于Pre-PHC 組；Comb-PHC 組在T3、T4時間點TNF-α、IL-6 均低于Pre-PHC 組，IL-10 均高于Pre-PHC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Comb-PHC 組在T2～T4時 間 點TNF-α、IL-6 均低于Post-PHC組，IL-10 均高于Post-PHC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠不同時間點OI、RI 的比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠不同時間點OI、RI 的比較（±s，n=10）

注：與CPB 組相比，*P＜0.05；與Pre-PHC 組相比，ΔP＜0.05；與Post-PHC 組相比，□P＜0.05

指標 組別 T1 T2 T3 T4 OI Shame 組 467.4±21.7 464.9±24.9 458.9±21.8 475.5±21.2 CPB 組 462.5±22.2 326.5±24.8 281.9±18.6 217.1±22.4 Pre-PHC 組 470.2±23.1 383.3±22.3* 319.3±19.7* 243.2±20.3*Post-PHC 組 464.9±27.3 324.8±26.4Δ 310.7±22.4* 251.8±20.8*Comb-PHC 組 462.4±28.5 366.4±26.9*Δ□ 336.9±21.3*Δ□ 295.3±23.2*Δ□RI Shame 組 0.445±0.052 0.509±0.045 0.531±0.041 0.484±0.039 CPB 組 0.439±0.055 2.159±0.047 2.893±0.038 2.475±0.035 Pre-PHC 組 0.452±0.048 1.711±0.065* 2.403±0.081* 2.248±0.077*Post-PHC 組 0.446±0.043 1.986±0.070Δ 2.352±0.076 *Δ 2.261±0.083*Comb-PHC 組 0.451±0.050 1.812±0.068*Δ□ 2.213±0.075*Δ□ 2.089±0.082*Δ□

表2 各組大鼠不同時間點TNF-α、IL-6、IL-10 的表達情況（±s，pg /ml）

表2 各組大鼠不同時間點TNF-α、IL-6、IL-10 的表達情況（±s，pg /ml）

指標 組別 T1 T2 T3 T4 TNF-α Shame 組 37.53±3.56 54.34±4.77 60.57±6.44 56.75±5.89 CPB 組 38.66±3.87 89.46±6.87 143.34±8.54 106.34±7.66 Pre-PHC 組 37.87±3.29 70.39±5.53* 115.17±7.45* 92.13±6.57*Post-PHC 組 38.19±3.40 88.78±6.57Δ 110.23±7.38* 87.72±7.51*Comb-PHC 組 38.21±3.62 79.13±5.72*Δ□ 100.53±6.89*Δ□ 80.18±6.71*Δ□

續(xù)表2

3 討論

在多個呼吸指標中，氧合指數(shù)（OI）及呼吸指數(shù)（RI）是最直接、準確反映肺損傷程度的指標。TNF-α是機體炎性反應(yīng)出現(xiàn)最早的內(nèi)源性介質(zhì)，是炎性反應(yīng)最敏感的指標，同時也是各種促炎因子的始動因素，IL-6 是TNF-α 激活的白細胞介素家族成員，是起到放大與加速的關(guān)鍵中繼因子。IL-10 通過抑制抗原細胞抗原提呈與抑制細胞因子釋放表現(xiàn)出免疫抑制與抗炎作用，是抑制炎性反應(yīng)的關(guān)鍵指標，是ALI 病理生理過程中的保護性因 子[6～9]。研究表明鹽酸戊乙奎醚能夠通過抑制炎性啟動因子TNF-α釋放、減輕IL-6 介導(dǎo)的瀑布樣放大及加速反應(yīng)，增強IL-10 因子，從而表現(xiàn)出對肺損傷的保護作用[10，11]。

本實驗中通過觀察各組呼吸指標及炎性指標發(fā)現(xiàn)，CPB 轉(zhuǎn)流期間有大量炎性因子產(chǎn)生，CPB 結(jié)束自主循環(huán)恢復(fù)后堆積的炎性因子爆發(fā)式釋放導(dǎo)致術(shù)后1h（T3）TNF-α、IL-6、IL-10 達到峰值，在術(shù)后4h（T4）炎性因子即開始緩慢下降。呼吸性指標的抑制隨著炎性因子釋放隨之關(guān)聯(lián)波動。觀察PHC 干預(yù)組發(fā)現(xiàn)，PHC 能夠有效減輕CPB 導(dǎo)致的急性肺損傷。對比不同處理方式，PHC 預(yù)處理在心肺轉(zhuǎn)流后其保護作用不斷下降；PHC 后處理能夠有效抑制CPB 轉(zhuǎn)流后肺損傷因子的釋放。觀察至實驗終點，Pre-PHC、Post-PHC 組的差異已沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但聯(lián)合處理組（Comb-PHC 組）的呼吸指標及炎性因子水平仍明顯優(yōu)于Pre-PHC、Post-PHC 組。

目前實驗與臨床應(yīng)用PHC 多集中于預(yù)處理或后處理單一的干預(yù)方式[12，13]。CPB 心肺轉(zhuǎn)流的過程中會出現(xiàn)血液稀釋與體液、血液的再分布這種特殊病理生理狀態(tài)。預(yù)處理的給藥方式需考慮CPB轉(zhuǎn)流血液稀釋的影響導(dǎo)致效能減低，后處理的方式則在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流過程中對肺組織缺少保護作用。此時，通過改進給藥方式則能夠消除單次給藥的不足，在CPB 轉(zhuǎn)流全程發(fā)揮保護作用。

綜上所述，鹽酸戊乙奎醚能夠抑制CPB 造成的急性肺損傷。通過對比不同的處理方式發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合預(yù)處理與后處理給藥的方式能夠發(fā)揮該藥在CPB導(dǎo)致肺損傷中的最大保護效能。