蔡輝 黃文利 孫朝輝

原發(fā)性醛固酮增多癥是以醛固酮分泌增多和血管緊張素原-腎素系統(tǒng)受抑制為表現(xiàn)的綜合征。其主要的病理特點(diǎn)為高血壓、血鉀水平紊亂和進(jìn)行性的靶器官損害。主要原因是特發(fā)性雙側(cè)腎上腺增生（IHA）和腎上腺腫瘤[主要表現(xiàn)為良性腎上腺皮質(zhì)瘤，其次為單側(cè)腎上腺增生和家族性醛固酮增多癥（GRA）]。GRA 是一種單基因性高血壓，并且是目前唯一的一種分子機(jī)制被弄清楚的PA[1]。原發(fā)性醛固酮增多癥（原醛癥）也是繼發(fā)性高血壓最常見的原因，既往認(rèn)為是一罕見的疾病，但隨著對(duì)此病的認(rèn)識(shí)和檢查手段的普及，其發(fā)病率也逐漸增高。目前很多研究都集中在揭露原醛癥的分子遺傳機(jī)制，有報(bào)道醛固酮合成酶基因（CYP11B2）多態(tài)性與原發(fā)性高血壓、左室肥厚和心肌梗死有關(guān)[2～4]。體外定點(diǎn)突變分析顯示，醛固酮合成酶的第288 位甘基酸和第320 位丙基酸分別對(duì)該酶的18-羥化酶活性和18-氧化活性具有非常關(guān)鍵的作用[5]。D147E 突變會(huì)使醛固酮合成增多[6]，而在皮質(zhì)酮甲基氧化酶缺乏的患者中發(fā)現(xiàn)很多突變會(huì)使醛固酮合成減少[7，8]。在國(guó)外SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)有多種錯(cuò)義突變，而這些突變很有可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變。本研究在體外克隆出人的醛固酮合成酶基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，并在NCI-H295R 細(xì)胞中表達(dá)，為下一步的突變分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 菌株E.coli DH5α和PcDNA3.1（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存（來(lái)自美國(guó)Stratagene 公司），其中PcDNA3.1（+）含CMV 啟動(dòng)子和新霉素（Neomycin） 抗性基因。PMD18-T 載體購(gòu)自大連寶生物公司。

1.1.2 主要試劑 RNA 提取試劑—陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO 公司；凝膠回收試劑盒、限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、T4DNA 連接酶、PCR 反應(yīng)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和D2000Marker、100bpMarker 購(gòu)自天根生物公司；胰蛋白酶（Trypsin）購(gòu)自Gibco 公司；醛固酮放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；NCIH295R 細(xì)胞（人腎上腺上皮細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室保存（來(lái)自ATCC）；培養(yǎng)H295R 細(xì)胞用的DMEM/F12 培養(yǎng)基（包含365mg/ml L-glutamine和15mM Hepes）購(gòu)自Gibco 公司；1%ITS（由胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒組成的混合物）和2%Nuserum 購(gòu)自Soprachem 公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius Bio Imaging System）為Synegene 公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 PCR 引物 參照GenBank 上公布的序列（登錄號(hào)：D13752），應(yīng)用Primer 5.0 和 oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)引物：上游P1：5'-CGGAAGCTTGGAGCACTC AGG-3'，下游P2：5'-CTGGAATTCAGTTAATCGCTC TGAAAGTGAGG-3'，上下游劃線部分分別為Hind Ⅲ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，上游粗體部分為KOZAK 序列，斜體部分為保護(hù)堿基，方框內(nèi)為起始密碼。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增 用RNA 提取試劑從人的腎上腺組織中提取總的RNA（具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：65℃ 5min，立即置冰上冷卻；30℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μl：RNase Free H2O 8μl，Random Primer 1μl，RNA 3μl，5×RT Buffer 4μl，10mM dNTPs 2μl，Rnase inhibitor 1μl，Rever TraAce 1μl。

以cDNA 為模板，特異性上下游引物通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系50μl：去離子水36.5μl，10×probest bufferⅡ5μl，2.5mM dNTP 4μl，上下游引物各1μl，probest 高保真 酶0.5μl，cDNA 模板3μl。PCR 反應(yīng)條件：采用Touchdown 程序?qū)崿F(xiàn)特異擴(kuò)增，94℃ 5min，94℃ 30s，從68℃開始，每2度遞減1 次，直到60℃，共5 個(gè)溫度（68℃、66℃、64℃、62℃、60℃）。每個(gè)溫度2 個(gè)循環(huán)，共10 個(gè)循環(huán)。最后以58℃循環(huán)25 次。每個(gè)循環(huán)的條件是變性30s，退火30s，延伸1min 45s，循環(huán)結(jié)束后以72℃延伸5min，4℃保存。

PCR 程序如下：

最后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的條帶約在1 500bp 左右，并割下目的條帶。

1.2.2 目的基因克隆 用晶美生物公司的凝膠純化回收試劑盒將PCR 產(chǎn)物純化回收（具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行）。將目的基因與T 載體按照比例16℃連接過(guò)夜，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化后的DH5α 涂布于含100mg/L 氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)12～16h 后，挑取菌落于試管中小量擴(kuò)增過(guò)夜，通過(guò)菌液PCR 和雙酶切初步鑒定為陽(yáng)性克隆后送往北京奧科公司測(cè)序。

1.2.3 目的基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 從測(cè)序鑒定正確的重組體中提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制酶將目的基因從T 載體上酶切下來(lái)，將目的基因純化回收后與用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的PcDNA3.1（+）連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 大腸桿菌，37℃培養(yǎng)12～16h，從含氨芐青霉素的LB 平板上隨機(jī)挑取菌落。通過(guò)菌液PCR 和雙酶切初步鑒定。

1.2.4 目的基因序列測(cè)定 將初步鑒定為陽(yáng)性克隆的重組體送往北京奧科公司雙向測(cè)序。通過(guò)Blast，DNAMAN 軟件對(duì)核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank 上的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.5 轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒DNA 的制備 純化以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取質(zhì)粒PcDNA3.1（+）和PcDNA3.1/P450Aldo。經(jīng)分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)，A260/A280＞1.8，且無(wú)任何降解的DNA 用于轉(zhuǎn)染。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染用 含1% ITS 和2%Nuserum 的DMEM/F12 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2 的 培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)H295R 細(xì)胞。利用脂質(zhì)體法，將表達(dá)載體PcDNA3.1/P450Aldo 導(dǎo)入細(xì)胞中，對(duì)照組用空載體PcDNA3.1 轉(zhuǎn)染。6 孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)棄培養(yǎng)液，加入OPTI-MEMI 培養(yǎng)液500μl，將4μg DNA 和10μl lipofectamine 2 000 分別加入250μl OPTI-MEMI 中，5min 后將兩者混合，室溫放置25min 后加入培養(yǎng)液，空白組加入等體積的OPTI-MEMI。培養(yǎng)箱中放置5h 后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48h 后收獲細(xì)胞，并取細(xì)胞培養(yǎng)液作為放射免疫法（RIA）檢測(cè)醛固酮樣品。

1.2.7 RT-PCR 檢測(cè)CYP11B2 mRNA 的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48h 后收獲細(xì)胞，提取RNA 后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，最后以CYP11B2 基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增并以GAPDH 做內(nèi)參。

1.2.8 細(xì)胞上清醛固酮的檢測(cè) 使用北京北方生物技術(shù)研究所的醛固酮放射免疫分析試劑盒對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行醛固酮檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用±s表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 從腎上腺組織中RT-PCR 擴(kuò)增目的基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)產(chǎn)物約為 1 535bp，如圖1所示。

圖1 CYP11B2 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 目的基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組體的鑒定菌液PCR 擴(kuò)增可見約1 535bp 左右大小的片段，如圖2所示。將菌液PCR 初步鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，可見兩條條帶，一條約 5 400bp，為PcDNA3.1（+），一條約1 535bp 為目的條帶。如圖3所示。

圖2 菌液PCR 產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

2.3 目的基因序列測(cè)定 真核表達(dá)質(zhì)粒的目的基因全長(zhǎng)有1 509bp，編碼503 個(gè)氨基酸。通過(guò)Blast，DNAMAN 軟件對(duì)核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank 上的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)，有1 個(gè)核苷酸改變（A3323G），1 個(gè)氨基酸改變（K173R），核苷酸序列同源性為99.9%，氨基酸序列的同源性為99.8%。

2.4 轉(zhuǎn)染后RT-PCR 檢測(cè)CYP11B2 mRNA 的表達(dá)可以看到重組質(zhì)粒PcDNA3.1/P450Aldo轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，空載體PcDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染組和未經(jīng)任何質(zhì)粒處理的細(xì)胞組（空白組）在1 535bp 左右處均出現(xiàn)一條特異性的擴(kuò)增帶，與P450Aldo cDNA 編碼區(qū)的大小相符。但空載體組和空白組的條帶明顯較轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PcDNA3.1/P450Aldo 組弱，如圖4所示。

圖4 三組CYP11B2mRNA 的表達(dá)

2.5 細(xì)胞上清中醛固酮的檢測(cè) 空載體組和空白組分別為（2.68±0.56）μg/ml 和（2.83±0.49）μg/ml，PcDNA3.1/P450Aldo 轉(zhuǎn)染組為（8.61±0.75）μg/ml，明顯高于前面兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

存在于基因編碼序列中的SNP，稱為編碼SNP（coding SNPs，cSNPs）。人類基因組共有25～40 萬(wàn)個(gè)cSNP。其中20%～30%能引起氨基酸的編碼序列發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能變化。分析改變氨基酸的cSNP 成為研究基因及蛋白質(zhì)功能的方法之一[9]。

醛固酮是人體內(nèi)重要的鹽皮質(zhì)激素，除了保鈉排鉀可以引起水鈉潴留外，還可以刺激鈉通道蛋白、膠原蛋白合成增多，促進(jìn)膠原合成沉積，使心臟、血管以及其他器官纖維化和結(jié)構(gòu)重塑，在高血壓、心力衰竭及心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[10]。

合成醛固酮的關(guān)鍵酶醛固酮合成酶的編碼基因?yàn)镃YP11B2。在CYP11B2 基因啟動(dòng)子區(qū)- 344T/C 多態(tài)性的研究中，發(fā)現(xiàn)不同基因型人群的醛固酮濃度不同，并且該多態(tài)性與高血壓、缺血性心臟病、小動(dòng)脈順應(yīng)性相關(guān)[2～4]。在編碼區(qū)中也存在幾十種多態(tài)性，其中約有11 種錯(cuò)義突變。有些錯(cuò)義突變點(diǎn)位于酶活性作用發(fā)揮的關(guān)鍵部位，比如底物結(jié)合部位或是血紅素結(jié)合域等。這些SNP 有待于進(jìn)一步研究其功能變化。因此，本實(shí)驗(yàn)體外克隆了人的CYP11B2 基因并構(gòu)建出真核表達(dá)載體為今后的定點(diǎn)突變分析奠定了基礎(chǔ)。

由于CYP11B2 基因和CYP11B1 基因（編碼類固醇羥化酶）外顯子有95%的同源性[1]，我們?cè)谡J(rèn)真比對(duì)這兩個(gè)基因5'末端和3'末端后在差異明顯處設(shè)計(jì)引物，并且為了以后亞克隆和表達(dá)需要分別設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)和柯薩克（KOZRK）序列。從腎上腺組織中提取總的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA 后，擴(kuò)增出了目的基因。在實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)選用高保真的Probest 酶并采用特異性強(qiáng)的TouchDown PCR 對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，以及利用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行克隆篩選、測(cè)序鑒定等方法確保了該重組載體能正確編碼P450Aldo 蛋白的氨基酸序列。

表達(dá)載體的構(gòu)建是在細(xì)菌質(zhì)粒上引入一個(gè)真核啟動(dòng)子，在啟動(dòng)子的下游插入目的編碼基因，其后有poly A 和轉(zhuǎn)錄終止序列，即在一個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒上克隆進(jìn)某種編碼基因的cDNA 序列。構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí)，載體啟動(dòng)子類型直接影響質(zhì)粒DNA 在體內(nèi)表達(dá)外源蛋白水平，最常用的啟動(dòng)子來(lái)源于人巨細(xì)胞病毒（hCMV），其可在多種細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)而有效的表達(dá)[11]。PcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體即采用該啟動(dòng)子。此載體中含真核表達(dá)組件，f1 噬菌體的復(fù)制起始區(qū)用于大腸桿菌內(nèi)單鏈的合成，pMB1復(fù)制起始子用于在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制，SV40 復(fù)制起始區(qū)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。PcDNA3.1 的聚苷酸化信號(hào)來(lái)源于牛生長(zhǎng)激素，可提高克隆基因的穩(wěn)定性及翻譯效率，促進(jìn)有效表達(dá)[12]。多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T4 噬菌體啟動(dòng)子，使插入的外源DNA 在每一條鏈都能進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，表達(dá)由CMV 早期啟動(dòng)子啟動(dòng)。由于質(zhì)粒上不僅有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，而且有真核啟動(dòng)子，所以表達(dá)載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制，又可在真核細(xì)胞表達(dá)。質(zhì)粒經(jīng)過(guò)在細(xì)菌中擴(kuò)增，提取和純化就可以直接用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示克隆的CYP11B2 基因全長(zhǎng) 1 509bp，編碼由503 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為48.5KD。重組真核表達(dá)質(zhì)粒的目的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank 上公布的序列比較有1個(gè)核苷酸差異，相對(duì)于起始密碼子ATG 的第518 位由A →G，基因序列同源性為99.8%。這個(gè)核苷酸差異引起第173 位的氨基酸改變，即K 賴氨酸→R精氨酸，蛋白質(zhì)序列同源性為99.9%。與國(guó)外SNP數(shù)據(jù)庫(kù)比較，這個(gè)核苷酸變異是一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，編號(hào)為rs4539。體外功能分析顯示這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)K173R 對(duì)醛固酮合成酶的活性無(wú)影響，與原醛癥及原發(fā)高血壓無(wú)明顯相關(guān)[13]。但為了保證下一步定點(diǎn)突變結(jié)果的可靠性，我們?cè)O(shè)計(jì)兩條定點(diǎn)突變引物5'-GGT TGC TGG CTT CTA TGG TGT AGT GGA AG-3' 和5'-CTC CCA GGC CCT GAA GAA GAA GGT G-3'，采用重疊PCR 技術(shù)將173 位的精氨酸突變成賴氨酸。將測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)，結(jié)果完全一致，核苷酸序列同源性為100%，未引入其它突變位點(diǎn)。

在體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，我們采用了陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，Lipofectamine? 2000 轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單方便。所選用的宿主細(xì)胞為腎上腺上皮細(xì)胞NCI-H295R，來(lái)源于非侵襲性的腎上腺皮質(zhì)腫瘤，它是第一種也是唯一的人類腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生和分泌三種腎上腺皮質(zhì)激素—糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和雄激素，可以很好地用于人類類固醇激素生成的研究[14]。轉(zhuǎn)染后經(jīng)RT-PCR 和放免法檢測(cè)醛固酮可以看到三組均可見目的條帶以及醛固酮的生成，這是因?yàn)榧?xì)胞本身含有合成類固醇激素的關(guān)鍵酶，但轉(zhuǎn)染組與空白組和空載體組相比，條帶亮度明顯增強(qiáng)，醛固酮的量也顯著增多，說(shuō)明重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中表達(dá)。

PcDNA3.1/P450Aldo 真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建，為下一步定點(diǎn)突變分析奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。