田瑞雪 孫耀宗 姚有昊 張子健 張繼民 宋維芳

免疫系統(tǒng)作為機(jī)體十分重要的系統(tǒng)發(fā)揮著免疫防御、免疫監(jiān)視及免疫自穩(wěn)的作用。環(huán)磷酰胺作為臨床常用的抗腫瘤化療藥，在抗腫瘤的同時會廣泛殺傷免疫細(xì)胞造成機(jī)體免疫低下，因此實(shí)驗中常被用來制造小鼠免疫低下模型[1，2]。當(dāng)免疫力低下時，機(jī)體不能及時清除衰老損傷突變細(xì)胞，不能及時清除入侵的病原體，導(dǎo)致腫瘤和感染的發(fā)生。因此提高機(jī)體免疫功能對于維持機(jī)體健康、抵御疾病具有重要意義，尤其是對化療后造成免疫低下的患者意義重大。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，其化學(xué)名為 3'，4'，3，5，7-五羥基黃酮，廣泛存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中。槲皮素具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等多方面的藥理作用[3～6]。有研究表明槲皮素可以促進(jìn)正常小鼠T 細(xì)胞亞群分化，也可通過抑制病理性CD4+T 細(xì)胞治療自身免疫性心肌炎[7]，對免疫細(xì)胞具有雙相調(diào)節(jié)作用[8]。Singh 等[9]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以增強(qiáng)免疫低下小鼠Th2 細(xì)胞免疫。另有研究表明，黃酮類化合物可以促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10～12]。Fan 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭總黃酮對免疫低下小鼠有免疫調(diào)節(jié)作用。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮對正常小鼠有免疫促進(jìn)功能。槲皮素作為一種重要的黃酮類化合物，是否對小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，尤其是對免疫低下小鼠模型的作用未見報道。本實(shí)驗通過對環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)，免疫器官指數(shù)，T、B 細(xì)胞增殖功能，巨噬細(xì)胞吞噬能力，CD4比例及CD4/CD8 比值，脾淋巴細(xì)胞凋亡率檢測來探討槲皮素對免疫低下小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 流式細(xì)胞儀，BECKMAN，美國；Eppendorf 微量移液器，德國；酶標(biāo)儀，MD，美國；顯微鏡，Leica，德 國；anti-mouse CD4 PE-Cy5、anti-mouse CD8a PE、為美國eBioscience 公司產(chǎn)品；AnnexinVFITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒為北京四正柏生物公司產(chǎn)品；槲皮素（Quercetin，Que）購自上海生工生物公司；注射用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）購自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司（批號：17032125）；3-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）購自北京索萊寶公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗分組 雄性 C57BL/6 小鼠30 只，6 周齡，體重（20±2）g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，許可證號：SCXK（晉）2015-0001，合格證號：NO.16697。小鼠隨機(jī)分為正常對照組、CTX 組、Que 組，每組10 只。正常對照組、CTX 組小鼠灌胃NS（每日0.2ml/只），參照文獻(xiàn)[15]，Que 組小鼠灌胃Que 80mg/kg（每日0.2ml/只），連續(xù)灌胃20 天。第16 天，除正常對照組外其余兩組小鼠連續(xù)3 天腹腔注射CTX 50mg/kg。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 小鼠眼球采血20μl，加入 380μl 白細(xì)胞稀釋液（2%的冰醋酸）中，吹打均勻，改良牛鮑計數(shù)板充池進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。

小鼠稱重記錄后處死，解剖取胸腺、脾臟，電子秤稱重。計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）×10；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）×10。

收集小鼠脾細(xì)胞，調(diào)脾細(xì)胞濃度為1×105/ml，取100μl 于96 孔板，分別加入含ConA（終濃度為 5μg/ml）和LPS（終濃度為10μg/ml）的RPMI1640培養(yǎng)液100μl（設(shè)3 個復(fù)孔），同時設(shè)陰性對照，細(xì)胞培養(yǎng)72h 后加MTT（5mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，離心培養(yǎng)板，棄上清，加二甲基亞砜150μl/孔，振蕩，570nm 測OD 值，檢測T、B 細(xì)胞增殖功能結(jié)果以刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)（SI）=刺激孔（加 ConA 或LPS）OD 值/對照孔OD 值。

末次給藥前兩天，小鼠腹腔注射6%無菌淀粉溶液2ml，隔日處死小鼠，腹壁開小孔，生理鹽水反復(fù)吹吸收集腹腔懸液，離心收集細(xì)胞，6 孔板貼壁 3h，收集貼壁細(xì)胞，RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/ml。取100μl 于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育3h（設(shè)3 個復(fù)孔），棄上清，加0.1%的中性紅溶液200μl/孔，繼續(xù)孵育30min，棄上清后PBS 洗滌2次，加細(xì)胞解液（乙醇∶乙酸=1∶1）200μl/孔，過夜，490nm 測OD 值，檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能。

收集小鼠脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取100μl 加CD4 和CD8a 熒光抗體孵育0.5h，PBS 洗滌后200μl PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測CD4 比例及CD4/CD8 比值。取100μl 細(xì)胞加Binding buffer 100μl，加入5μl Annexin-V 和10μl PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測脾淋巴細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0 分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗和方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞計數(shù)及免疫器官指數(shù) 白細(xì)胞計數(shù)及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果顯示，與CTX 組相比，Que 組的外周血白細(xì)胞計數(shù)、體重及脾臟指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，Que 組的外周血白細(xì)胞計數(shù)、體重及胸腺指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 T、B 細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)果 MTT 法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，與CTX 組相比，Que 組的T 細(xì)胞增殖指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B 細(xì)胞增殖指數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能則無顯著差異。與正常對照組相比，Que 組的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞增殖指數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各組小鼠白細(xì)胞計數(shù)及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果（±s，n=10）

表1 各組小鼠白細(xì)胞計數(shù)及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果（±s，n=10）

注：與正常對照組相比，aP＜0.05；與CTX 組相比，bP＜0.05

組別 白細(xì)胞計數(shù)（×109/L） 體重（g） 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)正常對照組 9.90±1.26 22.51±1.90 31.01±5.38 31.16±3.12 CTX 組 4.27±0.57a 17.44±0.53a 19.16±4.23a 20.60±3.58a Que 組 6.94±2.19ab 19.92±1.49ab 23.15±6.72a 27.42±7.02b

表2 T、B 細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)果（±s，n=10）

表2 T、B 細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)果（±s，n=10）

注：與CTX 組相比，aP＜0.05；與正常對照組相比，bP＜0.05

組別 T 細(xì)胞（SI） B 細(xì)胞（SI） Mac（OD490nm）正常對照組 1.48±0.38 1.52±0.21 0.31±0.12 CTX 組 1.08±0.08b 1.03±0.14b 0.15±0.43b Que 組 1.37±0.12a 1.36±0.39 0.25±0.11

2.3 CD4，CD8 及CD4/CD8 檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞CD4、CD8 結(jié)果顯示，與CTX 組相比，Que 組的CD4 細(xì)胞比例及CD4/CD8 比值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，Que 組的CD4 細(xì)胞比例及CD4/CD8 比值降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 CD4，CD8，CD4/CD8 檢測結(jié)果（%，n=10）

2.4 脾淋巴細(xì)胞凋亡結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V和PI 雙染法檢測脾淋巴細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，正常對照組凋亡細(xì)胞比例為（0.76±1.1）%，CTX 組為（12.1±2.2）%，Que 組為（9.1±1.7）%。與CTX 組相比，Que 組的脾淋巴細(xì)胞凋亡比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，Que 組的脾淋巴細(xì)胞凋亡比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，CTX 組比例升高（P＜0.05）。

3 討論

胸腺和脾臟是重要的外周免疫器官。胸腺是T 淋巴細(xì)胞分化成熟的主要場所，胸腺刺激T 淋巴細(xì)胞后成為具有免疫活性的T 淋巴細(xì)胞，主要參與細(xì)胞免疫。脾臟含有T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，是漿細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體、淋巴細(xì)胞遷移和接受抗原刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答的重要場所，參與細(xì)胞免疫和體液免疫。CD4 比例及CD4/CD8 比值可以反映機(jī)體免疫狀況，當(dāng)腫瘤及免疫低下發(fā)生時，CD4 比例及 CD4/CD8 比值降低，當(dāng)自身免疫病發(fā)生時CD4 比例及CD4/CD8 比值升高。巨噬細(xì)胞吞噬功能也能較好地反映機(jī)體免疫狀態(tài)。機(jī)體免疫功能低下時也會出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增殖功能降低，凋亡增加。故本實(shí)驗選擇檢測白細(xì)胞數(shù)量、免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖率、巨噬細(xì)胞吞噬功能、CD4 比例及CD4/CD8比值及淋巴細(xì)胞凋亡率來反映免疫功能情況。

CTX 作為抗代謝促凋亡化療藥已經(jīng)廣泛用于各種腫瘤的治療中，但其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時會廣泛殺傷正常的免疫細(xì)胞，造成嚴(yán)重的免疫抑制，患者繼發(fā)免疫紊亂及感染，嚴(yán)重者危及生命。聯(lián)合其他藥物使用，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時減輕免疫抑制等嚴(yán)重的副作用是腫瘤臨床治療亟待解決的問題。Que是一種黃酮類化合物，廣泛存在于瓜果蔬菜中。已有各種研究表明，槲皮素具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫力的作用。本研究采用50mg/kg CTX 連續(xù)3 天腹腔注射建立小鼠免疫低下模型。研究結(jié)果顯示CTX 可顯著降低小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量，降低胸腺及脾指數(shù)；降低T、B 細(xì)胞增殖指數(shù)；降低巨噬細(xì)胞吞噬能力；降低脾淋巴細(xì)胞CD4 比例及CD4/CD8 比值；促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，表明采用50mg/kg CTX 連續(xù)3 天腹腔注射可建立免疫低下小鼠模型，該結(jié)果與 CTX 抗代謝促凋亡的藥理作用一致。80mg/kg Que灌胃治療后可顯著升高外周血白細(xì)胞數(shù)量、胸腺及脾指數(shù)；升高脾淋巴細(xì)胞CD4 比例及CD4/CD8 比值；促進(jìn)T、B 細(xì)胞增殖；提高巨噬細(xì)胞吞噬功能；降低淋巴細(xì)胞凋亡比率，有效改善小鼠免疫低下狀態(tài)。

由于Que 生物利用度低、水溶性差、代謝速度快及酶促降解等問題，動物體內(nèi)研究其抗炎及抗腫瘤功效時均發(fā)現(xiàn)小劑量效果低于中劑量甚至沒有效果[16]，因此本實(shí)驗采用大多數(shù)實(shí)驗使用的80mg/kg 的中劑量，高劑量Que 的療效有待進(jìn)一步研究。近年來，與Que 羥基反應(yīng)生成醚和酯、羰基氧的取代、與金屬形成配合物等槲皮素衍生物的出現(xiàn)，為Que 生物利用度低這一問題提供了較好的解決方案。