近20年來(lái),缺血性腦卒中的腦保護(hù)治療一直備受全世界腦研究者的關(guān)注,但諸多研究結(jié)果均未得到充分肯定[1-2],進(jìn)一步深入研究缺血性腦卒中的損傷與修復(fù)機(jī)制有著重要的臨床意義。 丁苯酞是我國(guó)目前應(yīng)用于臨床且被證明可有效改善缺血性腦卒中的新藥,多次被急性缺血性腦卒中診治指南推薦[3-4]。既往多個(gè)研究提示其藥效機(jī)制可能涉及多個(gè)病理機(jī)制,如細(xì)胞興奮毒性、線粒體及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[5-6],其中,線粒體保護(hù)、改善細(xì)胞能量代謝障礙是非常重要的環(huán)節(jié)。

NDUFA4L2蛋白是細(xì)胞線粒體呼吸鏈中復(fù)合體Ⅰ(Complex Ⅰ)亞基家族中一員[7]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),NDUFA4L2蛋白是唯一一個(gè)只存在于線粒體且在低氧環(huán)境高表達(dá)的ComplexⅠ亞基蛋白,其基因就是低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1a)的直接目標(biāo)基因[8]。低氧環(huán)境下,嗜銘細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)、腦細(xì)胞內(nèi)的線粒體NDUFA4L2蛋白水平均呈高表達(dá)趨勢(shì),故推測(cè)HIF-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ反應(yīng)軸可能與細(xì)胞低氧適應(yīng)性、細(xì)胞損傷保護(hù)有關(guān),但至今尚未有相關(guān)的報(bào)道證實(shí)。如前所述,NDUFA4L2蛋白僅在線粒體高表達(dá),那么,丁苯酞的線粒體藥效作用機(jī)制是否可能與NDUFA4L2蛋白相關(guān)?換言之,NDUFA4L2蛋白是否與腦保護(hù)機(jī)制有關(guān)?本研究以PC12細(xì)胞為載體,制作PC12細(xì)胞缺氧模型,在0、6、12、18、24、48 h不同時(shí)間段觀察PC12細(xì)胞形態(tài)變化及NDUFA4L2蛋白表達(dá)變化,探索PC12細(xì)胞缺氧模型不同時(shí)間點(diǎn)NDUFA4L2蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)及可能的有效時(shí)間窗,以證實(shí)NDUFA4L2蛋白對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用;其次,應(yīng)用丁苯酞預(yù)處理PC12細(xì)胞培養(yǎng)基,應(yīng)用Western blot半定量檢測(cè)NDUFA4L2蛋白,比較預(yù)處理前后NDUFA4L2蛋白變化,以期發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2蛋白與丁苯酞腦保護(hù)作用的關(guān)聯(lián),為腦保護(hù)治療的基礎(chǔ)與臨床研究提供部分實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 PC12細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所惠贈(zèng);光學(xué)顯微鏡OLMPUS-CKX31(日本OLMPUS公司);1640培養(yǎng)基(GIBCO公司);胎牛血清(GIBCO公司);馬血清(GIBCO公司);青鏈霉素雙抗混合液(GIBCO公司);胰酶消化液(GIBCO公司);三氣培養(yǎng)箱-3111(美國(guó)Thermo公司);NDUFA4L2抗體(Abcam公司);山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor? 647)熒光二抗(Abcam公司);倒置熒光顯微鏡(萊卡公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo公司);總蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程股份公司);DAPI(ROCHE 公司);丁苯酞原液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞形態(tài)觀察:使用1640培養(yǎng)基+2.5%胎牛血清+12.5%馬血清+1%青鏈霉素雙抗混合液作為培養(yǎng)液,PC12細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 PC12細(xì)胞缺氧模型制作、細(xì)胞形態(tài)觀察及標(biāo)本制作:利用三氣箱制作PC12細(xì)胞缺氧模型,PC12細(xì)胞放置缺氧恒溫箱(設(shè)置氧濃度為1%)中培養(yǎng)6、12、18、24、48 h,分別觀察每個(gè)時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)、爬片和樣品收集。收集到的樣品加0.2 mL RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液(含1%的蛋白酶抑制劑),充分吹打后收取蛋白。

1.2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn):細(xì)胞加含蛋白酶抑制劑的裂解液,4 ℃裂解30 min。裂解完后于4 ℃下12 000 r/min離心10 min,留取上清,通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,孵育一抗(β-actin 1∶5000、E-cadherin 1∶1000、Snail 1∶1000、Twist 1∶1000),孵育二抗(羊抗小鼠1∶10 000;羊抗兔1∶10 000),化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果,曝光,顯影定影后掃描。利用Graphpad prism分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,以目的條帶與內(nèi)參β-actin的平均吸光度比值表示相對(duì)表達(dá)水平,進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 丁苯酞預(yù)處理:丁苯酞注射液預(yù)處理,按不同濃度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)分成3組分別加入培養(yǎng)液中,將PC12細(xì)胞放置37 ℃5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,缺氧(1%氧濃度)培養(yǎng)12 h,后續(xù)進(jìn)行NDUFA4L2蛋白的Western blot檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17軟件對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,繪圖軟件為Graphpad prism,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,呈較規(guī)則圓形,折光度強(qiáng),成簇生長(zhǎng)(圖1A)。缺氧6 h(圖1B)、12 h(圖1C)、18 h(圖1D)、24 h(圖1E)、48 h(圖1F)后,細(xì)胞形態(tài)逐漸變不規(guī)則,折光度減弱,最終細(xì)胞固縮,脫落。

2.2 PC12細(xì)胞缺氧情況下NDUFA4L2的表達(dá)情況 Western blot灰度分析比較提示：6、12、18、24 h NDUFA4L2蛋白水平均明顯高于0 h(P<0.05),但NDUFA4L2蛋白表達(dá)水平與缺氧時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注:A:缺氧培養(yǎng)0 h(正常培養(yǎng));B:缺氧培養(yǎng)6 h;C:缺氧培養(yǎng)12 h;D:缺氧培養(yǎng)18 h;E:缺氧培養(yǎng)24 h;F:缺氧培養(yǎng)48 h。

注:與0 h 比較,*P<0.05，**P<0.01

2.3 丁苯酞預(yù)處理后NDUFA4L2蛋白表達(dá)情況 使用不同濃度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)丁苯酞注射液預(yù)處理后，灰度分析提示,與未預(yù)處理組相比,丁苯酞預(yù)處理后的NDUFA4L2蛋白表達(dá)水平均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注:NC:未預(yù)處理;與NC組比較,*P<0.05

3 討論

缺血性腦卒中發(fā)生后,血流中斷即使是幾分鐘,核心梗死區(qū)也會(huì)導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的損傷,只有缺血半暗帶區(qū)可能被神經(jīng)保護(hù)機(jī)制暫時(shí)保護(hù);氧和葡萄糖因血流中斷而缺乏,會(huì)即刻在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管(即神經(jīng)血管單元)之間產(chǎn)生大量聯(lián)級(jí)反應(yīng)性的分子路徑[9]。這些環(huán)節(jié)過(guò)程中,線粒體功能非常重要,除了直接影響能量代謝之外,還與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)[10]。

NDUFA4L2蛋白是細(xì)胞線粒體呼吸鏈中ComplexⅠ亞基家族中的一員,而ComplexⅠ的含量與缺氧有關(guān)，受低氧誘導(dǎo)因子(HIF)調(diào)節(jié)[11],由于NDUFA4L2 基因僅在線粒體編碼,NDUFA4L2蛋白是唯一一個(gè)低氧環(huán)境高表達(dá)ComplexⅠ亞基蛋白[7-8],故備受關(guān)注。Tello等[8]提出“線粒體HIF-1a-NDUFA4L2蛋白相關(guān)的低氧適應(yīng)模型”,即缺氧條件下HIF-1a上調(diào)線粒體NDUFA4L2蛋白水平,NDUFA4L2蛋白抑制電子傳遞過(guò)程的ComplexⅠ活性,其結(jié)果是氧氣消耗減少,活性氧(ROS)的產(chǎn)量顯著減少,從而使細(xì)胞能夠適應(yīng)低氧環(huán)境;但是,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),NDUFA4L2蛋白水平也會(huì)逐漸下降,這可能是細(xì)胞在缺氧條件下于有效時(shí)間內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制。Li等[12]通過(guò)缺氧再灌注(hypoxia-reperfusion, H/R)模型模擬心肌缺血/再灌注(ischaemia/reperfusion I/R)損傷模型,證實(shí)了NDUFA4L2可以通過(guò)Complex Ⅰ來(lái)預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡和線粒體功能失調(diào),從而預(yù)防H/R損傷。心肌缺血損傷修復(fù)與腦缺血損傷修復(fù)有類(lèi)似之處,且缺氧條件下NDUFA4L2蛋白在腦組織中呈高表達(dá)水平,因此我們推測(cè),腦卒中后可能也存在HIF-1a-NDUFA4L2-ComplexⅠ保護(hù)機(jī)制。

PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元的前體細(xì)胞,能夠很大程度地反映神經(jīng)元在不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能變化,并彌補(bǔ)神經(jīng)元不能傳代在實(shí)驗(yàn)中所造成的不便制作。所以,利用PC12細(xì)胞制作缺氧模型模擬腦缺血性卒中模型是可取的。本研究通過(guò)對(duì)24 h內(nèi)PC12細(xì)胞缺氧模型不同時(shí)間段的NDUFA4L2蛋白Western blot定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺氧24 h內(nèi)NDUFA4L2蛋白水平普遍增高,但與缺氧時(shí)間無(wú)相關(guān)性,提示24 h內(nèi)NDUFA4L2蛋白可能對(duì)缺氧環(huán)境下PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。另外,通過(guò)細(xì)胞外形觀察,缺氧對(duì)PC12細(xì)胞損傷明顯,與時(shí)間呈正相關(guān),尤以48 h后細(xì)胞損傷顯著,貼壁困難,影響48 h以后缺氧模型的建立及相關(guān)研究的進(jìn)行,故本研究主要集中于24 h以內(nèi)細(xì)胞缺氧模型的研究。

丁苯酞在治療缺血性腦卒中時(shí),其發(fā)揮藥效的機(jī)制多數(shù)和線粒體有關(guān)[13-14]。NDUFA4L2蛋白作為新發(fā)現(xiàn)分子,其作用靶點(diǎn)也與線粒體能量代謝、ROS、細(xì)胞低氧適應(yīng)性有關(guān),與目前研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞的藥效機(jī)制有共通之處。本研究中,PC12在不同濃度丁苯酞預(yù)處理、缺氧培養(yǎng)12 h后,NDUFA4L2蛋白表達(dá)水平均高于未預(yù)處理組,提示丁苯酞預(yù)處理對(duì)缺氧24 h以內(nèi)PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。NDUFA4L2蛋白可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及上述分析,推論HIF-1a-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ路徑可能是丁苯酞保護(hù)線粒體、抗氧化應(yīng)激等的藥效作用機(jī)制之一,NDUFA4L2蛋白可能與腦保護(hù)機(jī)制有關(guān),NDUFA4L2蛋白相關(guān)的HIF-1a-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ通路可能是腦保護(hù)研究的一個(gè)新路徑或靶點(diǎn),有進(jìn)一步探索和研究?jī)r(jià)值。