余 彬，饒友義，寧 紅，高秀容，許小紅，黃毅嵐

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部(瀘州 646000);2.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 藥學(xué)部(綿陽(yáng) 621000);3.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610500)

藥物治療是抗腫瘤的有效方法之一，其中藥物的聯(lián)合使用尤為重要。多西紫杉醇(docetaxel, DTX)又名多西他賽，是紫杉烷類第二代抗癌藥[1-3]，其療效優(yōu)于紫杉醇。作為臨床常用的抗腫瘤一線藥物，也常與其他抗腫瘤藥物進(jìn)行聯(lián)合使用治療腫瘤，其中包括抗腫瘤中藥注射液。消癌平注射液取自烏骨藤的根和藤莖，并經(jīng)提取而制成[4]，具有能夠殺滅多種腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，與化療藥物聯(lián)合使用可明顯增強(qiáng)化療療效，降低化療引起的不良反應(yīng)[5]。

目前，中西藥聯(lián)用治療惡性腫瘤的情況日益普遍[6]，其中也包括DTX注射液聯(lián)用消癌平注射液，而DTX需經(jīng)CYP3A4酶進(jìn)行代謝[7]，而本團(tuán)隊(duì)前期研究[8]結(jié)果表明消癌平對(duì)CYP3A4酶具有抑制作用，因此當(dāng)兩藥聯(lián)合使用時(shí)，DTX代謝很可能會(huì)被抑制，引起血藥濃度增加及療效的增強(qiáng)，但仍缺乏進(jìn)一步的相關(guān)研究進(jìn)行佐證。故本團(tuán)隊(duì)以大鼠作為研究對(duì)象，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法探討消癌平對(duì)DTX大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證消癌平對(duì)DTX的抑制作用，并為兩藥在腫瘤患者的聯(lián)合使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重(200±10) g，共計(jì)24只，并采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)分為4組，每組6只大鼠，4組大鼠分別編為分為A、B、C、D組，大鼠由西南醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物的許可證為SCXK (川)2012-17。大鼠采用分籠飼養(yǎng)，1籠1只，每日給予食物和水。大鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)中心相對(duì)濕度在40%～60%之間，室溫控制在(23±3)℃。

1.2 藥品與試劑

消癌平注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：0.5 mL∶20 mg，批號(hào)15111215)；DTX對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度98.4%，批號(hào)100666-201403)；紫杉醇對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，批號(hào)100382-201603)。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其余為分析純。

1.3 儀器

HPLC儀(Ultimate 3000型，德國(guó)戴安公司)；醫(yī)用離心機(jī)(G16型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；旋渦混合器(HX-B型，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；電子天平(ME104型，德國(guó)Sartorius公司)。

1.4 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大鼠給藥前禁食不禁水12 h，A組大鼠僅給予DTX；B組大鼠給予DTX及消癌平(低劑量)；C組大鼠給予DTX及消癌平(中劑量)；D組大鼠給予DTX及消癌平(高劑量)。其中A組為空白組，B組為低劑量組，C組為中劑量組，D組為高劑量組。通過(guò)不同種屬之間的藥物劑量換算并依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定給予大鼠的DTX劑量為13.3 mg/kg， 消癌平的中劑量為5 mL/kg，依據(jù)中劑量開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大鼠的另外兩個(gè)劑量，最后確定消癌平的高劑量為中劑量的1.5倍，低劑量為中劑量的0.5倍。4組大鼠的DTX和消癌平分別前后給藥，消癌平在注射DTX前12 h進(jìn)行給藥，藥物經(jīng)尾靜脈注射，并于給藥后在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取血，依據(jù)的時(shí)間點(diǎn)為5、15、30 min和1、2、3、4、5、6、8、10 h， 取血量約0.5 mL， 并將采取得血樣置于離心管中，隨即進(jìn)行離心，分離后將血漿于-20℃冰箱內(nèi)保存至測(cè)定。

1.5 HPLC測(cè)定方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)控(QC)樣品溶液制備 1)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：精密稱取DTX對(duì)照品3.0 mg置于10 mL量瓶中，采用有機(jī)溶劑-甲醇進(jìn)行溶解，及定容至刻度線，得300 mg/L DTX儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液用甲醇-水(50∶50,V/V)稀釋，配制在0.781 3～100.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。2)內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取一定量DTX，用甲醇溶解定容，配制30.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液。3)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別將系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液50 μL加入至50 μL空白大鼠血漿中，混勻得質(zhì)量濃度為0.39、0.78、 1.56、3.12、6.25、 12.50、25.00、50.00 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。4)質(zhì)控(quality control,QC)樣品溶液：配制方法方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，得質(zhì)量濃度分別為1.56、6.25、25.00 mg/L的QC樣品溶液。

1.5.2 色譜條件 色譜柱為Nucleodur C18色譜柱(規(guī)格：5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為50%的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm；流速為1 mL/min；柱溫為室溫。

1.5.3 血漿樣品的處理和測(cè)定 取大鼠空白血漿約0.2 mL置于離心管內(nèi)，并在離心管中加入內(nèi)標(biāo)液(紫杉醇)30 μL和1 mL的三氯甲烷后進(jìn)行3 min的渦旋，隨即在轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，離心半徑10 cm的離心機(jī)內(nèi)離心10 min，完畢后將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，于離心管內(nèi)加入50%的乙腈水溶液并在氮?dú)庀轮敝链蹈?，隨后在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑10 cm的離心機(jī)內(nèi)離心20 min， 離心后取20 μL進(jìn)行分析，記錄色譜圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性考察

DTX、紫杉醇的保留時(shí)間分別為12.13、15.21 min，兩峰完全分離，且分離度R>1.5，DTX的對(duì)稱因子0.98，理論塔板數(shù)為9 400，紫杉醇的對(duì)稱因子為1.02，理論塔板數(shù)為11 000，且無(wú)其他干擾物質(zhì)存在，表明本色譜方法專屬性良好(圖1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限(lower limit of quantification，LLOQ)

計(jì)算DTX面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y(As/Ai)，以Y作為縱坐標(biāo)，血漿中DTX質(zhì)量濃度C(ng/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)(權(quán)重1/C2)回歸，得到DTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)r如下：Y=8.101 3X-3.265 2，r=0.999 3，最佳權(quán)重為: 1/C2。

在0.39～25.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DTX與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與DTX質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系，LLOQ為0.19 mg/L。

2.3 精密度

高、中、低3種質(zhì)量濃度的DTX連續(xù)3 d 內(nèi)日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.12%、3.68%、7.66%；日內(nèi)精密度的RSD值分別為3.84%、3.15%、6.38%(表1)。

圖1 高效液相色譜圖注：A：空白血漿；B：空白血漿+DTX(6.25 mg/L)與內(nèi)標(biāo)液；C：大鼠靜脈注射DTX 1 h后的血漿

質(zhì)量濃度/(mg/L)日間精密度實(shí)測(cè)值RSD/%日內(nèi)精密度實(shí)測(cè)值RSD/%1.561.51±0.127.661.52±0.106.386.255.89±0.223.676.15±0.193.1525.0024.66±0.773.1224.36±0.803.84

2.4 回收率

高、中、低3種濃度的DTX回收率的RSD分別為6.44%、3.82%、3.19%(表2)。

表2 待測(cè)組份在大鼠血漿中的回收率

2.5 穩(wěn)定性

參照SFDA“化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)中的相關(guān)技術(shù)”指導(dǎo)原則，對(duì)高(25 mg/L)、低(1.56 mg/L)兩個(gè)濃度樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。分別考察DTX血漿樣品在不同條件下的穩(wěn)定性，考察條件包括：樣品置于室溫下避光放置6 h、樣品1周內(nèi)連續(xù)反復(fù)凍融3次、 樣品置于-20 ℃冰箱中分別凍存15 d以及30 d，和處理后的樣品放在自動(dòng)進(jìn)樣架上(12 h，15 ℃)的穩(wěn)定性考察，在各條件下測(cè)得的RSD值均小于8%(表3)。

表3 各條件下穩(wěn)定性的RSD(%,n=6)

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

4組大鼠在給藥后，DTX的血藥濃度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制濃度-時(shí)間曲線圖，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS2.1.1軟件擬合(圖2、表4)。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)按非房室模型進(jìn)行擬合，從上表結(jié)果可知，B、C、D 3組的t1/2(α)、CL分別與A組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明消癌平對(duì)DTX的t1/2(α)以及CL沒(méi)有任何影響；僅D組的t1/2(β)與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明D組的消除半衰期有所延長(zhǎng)，其余兩組的消除半衰期沒(méi)有影響；C組和D組的AUC、Cmax、MRT與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明中劑量組和高劑量組的AUC和Cmax增大，MRT延長(zhǎng)，低劑量組未受影響。因此結(jié)合以上參數(shù)結(jié)果，當(dāng)兩藥聯(lián)合使用時(shí)，高劑量組的DTX t1/2(β)延長(zhǎng)，中劑量組和高劑量組的DTX AUC、Cmax增大，MRT延長(zhǎng)，CL和t1/2(α)未受影響，說(shuō)明在DTX在與消癌平合用時(shí)，DTX的清除減慢，導(dǎo)致血藥濃度增大，這也進(jìn)一步證實(shí)了本團(tuán)隊(duì)的期前研究結(jié)果，消癌平對(duì)DTX的消除具有抑制作用[8]。

圖2 DTX在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線圖

注：A：空白組與低劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；B：空白組與中劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；C：空白組與高劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；D：4組大鼠給藥后DTX的血藥濃度

表4 DTX的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：與A組比較，*P<0.05

3 討論

3.1 關(guān)于色譜條件的確定

色譜條件的確定有以下幾個(gè)要點(diǎn)：1)DTX的對(duì)稱因子較好；2)DTX和內(nèi)標(biāo)峰互補(bǔ)干擾，也都不被血漿雜質(zhì)峰所干擾；3)DTX以及內(nèi)標(biāo)峰的各自分離度(R)≥1.5；4)出峰時(shí)間較短。依據(jù)上述要求，并結(jié)合已有的實(shí)驗(yàn)條件及參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-13]進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定色譜條件為色譜柱。Nucleodur C18柱(規(guī)格：5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為50%的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm；流速為1 mL/min；柱溫為室溫。

3.2 關(guān)于動(dòng)物試驗(yàn)中給藥劑量的設(shè)計(jì)

按照說(shuō)明書中DTX用量，成人的常用劑量為75～100 mg/m2，根據(jù)文獻(xiàn)[14]和劑量換算公式，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定給予大鼠的靜脈注射劑量為13.3 mg/kg。說(shuō)明書中成人消癌平的給藥劑量為0.33～1.67 mL/kg，根據(jù)文獻(xiàn)[15-17]和劑量換算公式，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定給予大鼠消癌平的劑量(中劑量)為5 mL/kg。

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

在目前對(duì)DTX的HPLC研究中，內(nèi)標(biāo)物的選擇也多種多樣；大多采用地西泮作為內(nèi)標(biāo)物[14,18-19]。但本研究以紫杉醇作為內(nèi)標(biāo)物，紫杉醇是在DTX的結(jié)構(gòu)上改造而成，且兩藥的藥效作用相似。同時(shí)本研究的色譜條件下，內(nèi)標(biāo)峰的峰型對(duì)稱良好并不受干擾，也未干擾主峰，R滿足需求，且出峰時(shí)間早，因此本研究選擇紫杉醇作為內(nèi)標(biāo)物符合要求。

本研究結(jié)果顯示，DTX在大鼠體內(nèi)的血藥濃度有所增加，消癌平對(duì)DTX的多個(gè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有較大影響，結(jié)合其余參數(shù)結(jié)果，消癌平對(duì)多西紫杉醇的消除具有明顯的抑制作用，提示兩藥在聯(lián)合使用時(shí)，需嚴(yán)格的把握藥物的劑量，保障患者用藥的安全和有效。本團(tuán)隊(duì)將在此次試驗(yàn)和前期研究[8，20]的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用HPLC法探尋DTX與其他的抗腫瘤中藥注射劑(如：注射液香菇多糖、康艾注射液)之間潛在的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)等多種形式的藥物相互作用。