李靈玲，蘭景彬，何賢祿

1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院(成都 610091)；2.成都醫(yī)學院(成都 610500)；3.成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院(成都 610051)

結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)是全世界高發(fā)的惡性腫瘤之一，其致死率居各類腫瘤第2位。CRC發(fā)病率高，預后差，嚴重威脅著人們的健康生活[1]。目前，CRC常用的治療手段包括手術(shù)、放療及化療，但這些手段不良反應(yīng)大、復發(fā)率高，嚴重影響患者的治療。因此，尋找新的抗CRC藥物具有重要意義[2]。米諾環(huán)素是一種四環(huán)素類抗生素，主要用于治療痔瘡類疾病[3]。近期研究[4-6]顯示，米諾環(huán)素能有效抑制卵巢癌、骨癌、膠質(zhì)瘤，但關(guān)于米諾環(huán)素對CRC抑制作用的報道較少。本實驗以人CRC細胞LoVo細胞為研究對象，檢測米諾環(huán)素對LoVo細胞增殖和自噬水平的影響，并探討自噬在米諾環(huán)素抑制CRC細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人CRC細胞LoVo購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心，于-80 ℃凍存；米諾環(huán)素(質(zhì)量分數(shù)>98%)和自噬抑制劑氯喹(CQ)均購自上海阿拉丁生物科技有限公司；四唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)基Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)購自以色列BI公司；胎牛血清購自德國PAN公司；雙抗(青霉素、鏈霉素溶液)購自美國Hyclone公司；Atg5 siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)預染Marker購自美國Thermo Fisher公司；RIPA細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物公司；β-actin、Beclin1、p62、LC3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Cleaved-Caspase3、Cyt-C、Bax單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔二抗、鼠二抗均購自成都正能生物技術(shù)有限責任公司；ECL顯影液、PVDF 膜購自美國Millipore公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) LoVo細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測細胞活力 取對數(shù)生長期的LoVo細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細胞密度長至40%時，加入不同質(zhì)量濃度梯度(0.390 62、0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)米諾環(huán)素，放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置4個復孔，另設(shè)不含細胞僅有培養(yǎng)基的空白對照孔。44 h后，將加藥培養(yǎng)好的96孔板取出，在避光條件下向每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，以空白對照孔調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處的吸光度。

1.2.3 克隆形成實驗 取指數(shù)生長期的LoVo細胞，以100個/孔細胞接種于無菌六孔板中，搖勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用米諾環(huán)素(0、3、6 μmol/L)處理LoVo細胞，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，棄六孔板中液體，PBS洗滌3次，每次5 min。 用4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3次， 每次5 min。加入結(jié)晶紫，室溫，染色15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。觀察、拍照。

1.2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 用米諾環(huán)素(0、3、6 μmol/L)處理LoVo細胞，培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。每組收集約1×106個細胞，用PBS液洗1次，重懸，加入經(jīng)賴氨酸處理過的載玻片上，自然干燥。用4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗滌3次，每次5 min。然后加入含0.1% TritonX-100的PBS，冰浴孵育2 min，PBS洗滌3次，每次5 min，在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)凋亡細胞。

1.2.5 免疫熒光檢測自噬體的形成 參照文獻[7]方法，通過LC3抗體免疫熒光強弱檢測細胞自噬體的形成。在6孔板中放入處理過的蓋玻片，后將細胞鋪在蓋玻片上,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，用米諾環(huán)素(0、3、6 μmol/L)處理LoVo細胞，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定15 min， PBS溶液洗滌3次， 每次5 min。0.5% Triton X-100室溫通透20 min，PBS溶液洗滌3次，每次5 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，PBS溶液洗滌3次，每次5 min。LC3一抗室溫孵育1 h，PBS溶液洗滌3次，每次5 min。 FITC-熒光二抗室溫孵育1 h，PBS溶液洗滌3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀察，采集圖像。

1.2.6 MTT法測siRNA沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5后藥物對細胞的影響 取對數(shù)生長期結(jié)腸癌細胞LoVo以1×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入含血清和雙抗的正常培養(yǎng)基2 mL，以每100 μL培養(yǎng)基中含有150 ng Atg5 siRNA或Scramble siRNA并加入轉(zhuǎn)染試劑12 μL/孔，輕搖使溶液混合均勻，室溫中放置10 min。每孔100 μL輕輕加入6孔板中，混合均勻，37 ℃培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染后的細胞轉(zhuǎn)移到96孔板中。向LoVo細胞加入最終體積分數(shù)為0、3、6 μmoL/L米諾環(huán)素，37 ℃培養(yǎng)48 h。將加藥培養(yǎng)好的96孔板取出，在暗光條件下向每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)處理4 h后490 nm處的OD值。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法 收集經(jīng)藥物處理后的細胞，按照說明書，每1× 106個細胞加入100 μL RIPA 裂解液，振蕩混勻，超聲破碎細胞。12 000 r/min，4 ℃，離心15 min(離心半徑6 cm)，取上清用BCA蛋白定量試劑盒進行定量分析，以確保蛋白上樣量一致。加入上樣緩沖液，于90 ℃加熱變性10 min， 通過 12% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，加入稀釋的相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，加入ECL顯影液后暗室中通過X線片曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 米諾環(huán)素抑制CRC細胞的增殖

采用MTT實驗和克隆形成實驗檢測經(jīng)不同濃度的米諾環(huán)素處理CRC細胞LoVo 48 h后細胞活力的變化。MTT實驗結(jié)果顯示：米諾環(huán)素可促進LoVo細胞的胞內(nèi)毒性，細胞活力下降，且呈濃度依賴性?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示:米諾環(huán)素處理LoVo細胞后，細胞克隆數(shù)明顯減少，并且克隆數(shù)和米諾環(huán)素的濃度呈負相關(guān)。實驗結(jié)果表明：米諾環(huán)素能顯著抑制CRC細胞LoVo的細胞增殖，且抑制程度呈藥物濃度依賴性(圖1)。

圖1 米諾環(huán)素對CRC細胞增殖的影響

注：A：MTT實驗檢測米諾環(huán)素處理下LoVo的細胞活力；B：米諾環(huán)素處理下LoVo細胞的克隆形成情況及細胞克隆數(shù)統(tǒng)計；與空白對照組比較，ns：差異無統(tǒng)計學意義；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.2 米諾環(huán)素對CRC細胞凋亡的影響

采用TUNEL染色法和蛋白質(zhì)印跡法檢測經(jīng)0、3、6 μmol/L米諾環(huán)素處理LoVo細胞24 h后，細胞凋亡情況。TUNEL染色實驗結(jié)果顯示：米諾環(huán)素處理CRC細胞LoVo后，凋亡指數(shù)無明顯變化。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示：米諾環(huán)素處理CRC細胞LoVo后，Bax、Cyt-C、Cleaved-Caspase3等凋亡相關(guān)標志蛋白表達無明顯變化。實驗結(jié)果表明：米諾環(huán)素對CRC LoVo細胞增殖的抑制作用不是由細胞凋亡所致(圖2)。

2.3 米諾環(huán)素促進CRC細胞自噬

采用免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡法檢測米諾環(huán)素對CRC細胞LoVo自噬的影響。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：采用米諾環(huán)素(0、3、6 μmol/L)處理LoVo細胞24 h后，胞內(nèi)LC3熒光斑點數(shù)明顯增加，表明米諾環(huán)素促進自噬體的形成。經(jīng)米諾環(huán)素處理后，自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達增加，自噬抑制基因 p62 的表達降低。為進一步驗證米諾環(huán)素對CRC細胞自噬的影響，采用米諾環(huán)素單獨處理和米諾環(huán)素與自噬抑制劑氯喹(CQ)共處理CRC細胞LoVo后檢測LC3-Ⅱ表達情況。結(jié)果顯示：與CQ處理組相比，CQ和米諾環(huán)素共處理組LC3-Ⅱ含量明顯增加，表明米諾環(huán)素能誘導完整的自噬流。以上實驗結(jié)果表明：米諾環(huán)素促進CRC細胞自噬(圖3)。

圖2 米諾環(huán)素對CRC細胞凋亡的影響

注：A:TUNEL實驗檢測米諾環(huán)素處理下LoVo細胞的凋亡率；B:蛋白質(zhì)印跡法檢測米諾環(huán)素處理下凋亡相關(guān)標志蛋白的變化;與空白對照組比較，ns：差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05

圖3 米諾環(huán)素誘導CRC細胞產(chǎn)生自噬

注：A：免疫熒光檢檢測米諾環(huán)素處理下LoVo細胞中的LC3熒光斑點；B：蛋白質(zhì)印跡法檢測米諾環(huán)素處理下自噬相關(guān)標志蛋白的變化；C：米諾環(huán)素單獨處理和米諾環(huán)素與自噬抑制劑CQ共處理細胞LoVo后檢測LC3-Ⅱ表達情況

2.4 米諾環(huán)素促進自噬進而抑制CRC細胞增殖

采用siRNA沉默自噬相關(guān)基因Atg5后檢測米諾環(huán)素對CRC LoVo細胞活力的影響(圖4)。結(jié)果顯示：與對照組相比，米諾環(huán)素作用后，沉默組細胞活力有明顯回復。上述實驗結(jié)果表明米諾環(huán)素通過促進CRC細胞LoVo自噬，進而抑制CRC細胞增殖。

圖4 MTT法檢測siRNA沉默Atg5后米諾環(huán)素對CRC細胞增殖的影響

注：與siScramble組比較，**P<0.01

2.5 米諾環(huán)素抑制Akt/mTOR信號通路

采用免疫印跡檢測米諾環(huán)素對CRC LoVo細胞Akt、mTOR蛋白磷酸化水平的影響(圖5)。結(jié)果顯示：米諾環(huán)素處理LoVo細胞24 h后，p-Akt、p-mTOR的蛋白表達量均明顯下調(diào)，而Akt、mTOR的蛋白表達量未發(fā)現(xiàn)明顯差異。上述實驗結(jié)果表明：米諾環(huán)素通過抑制Akt/mTOR信號通路促進CRC細胞自噬，進而抑制CRC細胞增殖。

圖5 米諾環(huán)素對Akt、mTOR蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

CRC是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，由于其高發(fā)病率和死亡率而倍受人們關(guān)注[1]。CRC的早期診斷是目前人類需要攻克的一大難題，由于其早期發(fā)現(xiàn)率較低，許多患者診斷時已是進展期CRC。進展期CRC轉(zhuǎn)移率和手術(shù)復發(fā)性高，因此尋找妥善的CRC治療手段至關(guān)重要。米諾環(huán)素是二代半合成四環(huán)素類衍生物抗生素，最初主要被當作抗菌藥使用。近年研究[8-9]報道，米諾環(huán)素除抗菌作用外，還具抗炎抑制腫瘤增殖等作用。本研究證實米諾環(huán)素能夠有效抑制CRC細胞的增殖，并呈濃度依賴性。

誘導細胞凋亡是許多化療藥物抑制腫瘤細胞增殖的主要機制。為研究米諾環(huán)素抑制結(jié)腸癌細胞增殖的機制，本研究選取3、6 μmol/L米諾環(huán)素處理人CRC LoVo細胞后，釆用TUNEL染色及蛋白免疫印跡檢測，染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素組的細胞凋亡率與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義；而且蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素處理結(jié)腸癌細胞后凋亡相關(guān)標志蛋白(Bax、Cyt-c、Cleaved-Caspase3等)的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。該實驗結(jié)果提示米諾環(huán)素抑制CRC細胞增殖存在其他主要機制。

自噬是除凋亡外的另一種細胞程序性死亡方式，是一種將胞質(zhì)內(nèi)容物遞送給溶酶體進行降解的過程，也是維持真核細胞生存的重要調(diào)節(jié)過程。近年研究[10-11]表明，自噬是一把雙刃劍，一方面能促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展，另一方面又能介導腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡。如何運用好自噬這把雙刃劍是治療腫瘤的新方向。自噬的出現(xiàn)標志是自噬體的形成。本研究采用LC3抗體進行細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素處理CRC細胞后，胞質(zhì)中LC3熒光斑點數(shù)明顯增加，提示米諾環(huán)素誘導CRC細胞自噬體形成增加。進一步采用蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素組較正常組自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達增加，自噬抑制基因p62的表達降低。同時運用自噬抑制劑CQ發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合運用CQ和米諾環(huán)素較單用CQ能明顯增加LC3-Ⅱ表達，提示米諾環(huán)素能促進CRC細胞自噬。為了進一步研究細胞自噬是否在米諾環(huán)素抑制人CRC細胞增殖中起作用，采用siRNA沉默自噬相關(guān)基因Atg5后檢測發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素處理后，沉默組較正常組細胞活力有明顯回復，說明米諾環(huán)素通過促進細胞自噬，進而抑制CRC細胞增殖。自噬是一個十分復雜的生物學過程，涉及細胞內(nèi)關(guān)鍵分子事件的變化，其中，AKT/mTOR細胞信號轉(zhuǎn)導通路作為自噬最重要的上游調(diào)控因子而受到廣泛關(guān)注[12]。本研究證實米諾環(huán)素能夠抑制AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平從而抑制AKT/mTOR信號通路。

綜上所述，本研究結(jié)果解釋了米諾環(huán)素通過抑制Akt/mTOR信號通路促進自噬進而抑制CRC細胞增殖，為CRC治療奠定了理論基礎(chǔ)。