曹 藍，魯恩潔，陳藝韻，馬 鈺，李魁彪，陸劍云，狄 飚

A型流感病毒屬于正黏病毒科的單股、負鏈、分節(jié)段的RNA病毒，根據(jù)粒子表面血凝素(HA，Hemagglutinin)和神經(jīng)氨酸酶(NA，Neuraminidase)的抗原性可進一步劃分，HA有18個亞型(H1～H18)，NA有11個亞型(N1～N11)[1]。H3N2 亞型流感病毒自1968 年首次暴發(fā)后[2]，在全球范圍內(nèi)持續(xù)傳播引起季節(jié)性流行，流感病毒傳播迅速且廣泛，加之流感病毒HA 基因極易發(fā)生突變和重配，導致抗原漂移[3]，因此需要不斷監(jiān)測流行毒株以及時更新疫苗組分。有研究顯示H3N2 亞型流感病毒HA基因相對于其他季節(jié)性流感病毒抗原漂移頻率更快[4]，本研究監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，H3N2亞型流感病毒是2017年廣州市流感流行的主要病原，推測與攜帶有N21K位點突變的3C.2a1新流行分支出現(xiàn)有關，因此有必要對廣州H3N2流感病毒流行情況和基因變異特點進行監(jiān)測分析，為H3N2流感防控及疫苗株匹配性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1樣本來源 采集2017年1月-2018年9月廣州市4家流感病原學監(jiān)測哨點醫(yī)院流感樣病例咽拭子標本(流感樣病例定義：體溫≥38 ℃，有咳嗽或咽喉疼痛之一者)。采樣對象：發(fā)病3 d內(nèi)的流感樣病例。標本類型：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子和咽漱液。標本采集后放入含3～4 mL采樣液的采樣管中，并于2 個工作日內(nèi)運送至相應的流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室，保存溫度為2～8 ℃。

1.2病毒分離 提取病毒核酸，通過熒光定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法檢測A型和H3N2亞型流感病毒(病毒核酸提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，A型和H3N2亞型流感病毒熒光定量檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技有限公司)。將0.1 mL H3N2流感病毒陽性標本接種六孔板內(nèi)MDCK細胞，后放于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2 h。吸出接種物，清洗細胞2遍，然后加入病毒生長液于細胞板中，放置于33 ℃～35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細胞病變情況，當75%～100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，使用豚鼠血球(購于佛山聚聯(lián)生物技術有限公司)進行血凝實驗對病毒滴度進行測定。

1.3序列測定 應用Oligo 6軟件設計H3N2流感病毒HA基因全長擴增引物，引物由華大基因合成。通過RT-PCR方法擴增HA基因，將陽性鑒定產(chǎn)物送至廣州華大基因公司，通過ABI 3730進行病毒基因一代測序。

1.4HA基因分子特征分析 應用DNA Star7.1軟件拼接HA基因序列并對序列進行同源性分析。用MegAlign軟件比對抗原位點、受體結合位點、二硫鍵位點變異情況。使用在線糖基化預測軟件分析潛在糖基化位點[5]。

1.5HA基因遺傳進化分析 使用MEGA 4.0軟件，以HA基因ORF(Open Reading Frame)為基本單元，以WHO(World Health Organization)歷年北半球H3N2流感疫苗推薦株(A/Hong Kong/4801/2014，A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016，A/Switzerland/9715293/2013，A/Texas/50/2012，A/Perth/16/2009)和不同分支代表株(A/Hong Kong/3110/2017，A/Pennsylvania/28/2014，A/VICTORIA/506/2013，A/Samara/73/2013，A/Netherlands/525/2014，A/Ohio/02/2012，A/Stockholm/18/2011，A/Puerto Rico/36/2012，A/Madagascar/0648/2011，A/Montana/05/2011，A/Victoria/208/2009，A/Norway/1330/2010)HA基因作為參比序列(參比序列由GISAID數(shù)據(jù)庫提供)，繪制HA基因系統(tǒng)進化樹。繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設置為1000 replications)及Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。

2 結 果

2.1H3N2流感流行情況 2017年1月-2018年9月共累計檢測流感樣病例呼吸道標本8 535份，流感A通用陽性標本764份，陽性率為8.95%，H3N2流感陽性標本386份，陽性率為4.52%。監(jiān)測結果顯示，2017-2018年廣州市流感流行均呈雙峰流行特點，其中2017年以H3N2流行為主，3-8月為大流行高峰，9-11月為小流行高峰。2018年以H1N1流行為主，1-4月和6-9月為兩個流行高峰，見圖1。

2.2抗原位點變異分析 與當年度疫苗株A/Hong Kong/4801/2014相比，廣州市16株H3N2流感病毒HA基因核苷酸同源性在98.5%～99.1%之間，氨基酸同源性在97.9%～99.5%之間。H3N2流感病毒抗原表位主要位于HA1蛋白A-E5個抗原決定簇，與同年度疫苗推薦株A/Hong Kong/4801/2014相比較，廣州2017年H3N2流感抗原表位突變主要發(fā)生在A區(qū)，12株病毒在142位出現(xiàn)突變，6株病毒分別在144、150位出現(xiàn)突變。同時監(jiān)測到B區(qū)T128A、S198P，C區(qū)S312F，E區(qū)E62G、S91N均有發(fā)生突變，C區(qū)抗原位點相對保守，未監(jiān)測到突變。本研究毒株中有7株病毒出現(xiàn)2個或2個以上抗原位點變異，占比43.8%，詳見表1。

圖1 2017-2018年廣州市A型流感病毒流行情況Fig.1 Prevalence of influenza A virus in Guangzhou during 2017-2018

表1 H3N2流感病毒HA蛋白抗原位點變異分析
Tab.1 Mutation analysis of HA antigen of influenza A(H3N2) virus

毒株名稱ABCDE138142144145150128159194198454850278279312182214217629194262A/Hong Kong/4801/2014ARSSRTYLSNIEKSSVIIESYS2017XN21450-K--------------------2017XN21483-K--------------------2017XN21661----------------------2017XN23539-K--------------------2017XN23547-K--------------------2017XN23734-GK-K-----------------2017XN23828-K--------------------2017XN28801-G---A------------G---2017XN28806-GK-K-----------------2017XN28812--K-K-----------------2017XN30071-K--------------------2017XN30084-K--------------------2017XN30303-GK-K---------F----N--2017XN20899----------------------2017XN20929-K------P-------------2017XN21344--K-K-----------------

2.3受體結合位點變異分析 流感病毒受體結合位點位于HA1蛋白，有左壁(225-228位)、右壁(155位)、前壁(130-137位)、后壁(183位、190位、194位)和底壁(98位、153位)組成。與當年度疫苗推薦株A/Hong Kong/4801/2014相比較，2017年廣州H3N2流感病毒受體結合位點變異主要發(fā)生在前壁，所有毒株均在131位或135位出現(xiàn)變異，見表2。

2.4潛在糖基化位點和二硫鍵分析 HA1蛋白含有大量的糖類，大部分位于氨基酸末端，其位點增加或減少對流感病毒的抗原性及其他生物學特性均有一定影響[6]。分離毒株HA蛋白共有12個潛在糖基化位點，分別位于第8、22、38、63、122、126、133、158、165、246、285和483位，與疫苗株A/Hong Kong/4801/2014相比，部分毒株分別在126位、133位和158位有糖基化位點缺失，另有2株病毒在135位增加了糖基化位點，其中2017XN28801毒株連續(xù)在126位和133位出現(xiàn)兩個糖基化位點缺失，詳見表3。HA蛋白上由12個不同位點的半胱氨酸共組成6個二硫鍵，與疫苗株相比，本研究毒株HA蛋白二硫鍵均未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換或插入。

表2 H3N2流感病毒受體結合位點變異情況
Tab.2 Variation of receptor binding sites of influenza A(H3N2) virus

毒株名稱左壁右壁前壁后壁底部225-228155130-13718319019498153A/Hong Kong/4801/2014DIPSTVTQNGTSSHDLYW2017XN21450—--K--------2017XN21483—--K--------2017XN21661—----N-------2017XN23539—--K--------2017XN23547—--K--------2017XN23734—----K-------2017XN23828—--K---------2017XN28801—----K-------2017XN28806—----K-------2017XN28812—----K-------2017XN30071—--K--------2017XN30084—--K--------2017XN30303—----K-------2017XN20899—----N-------2017XN20929—--K--------2017XN21344—----K-------

表3 H3N2流感病毒HA蛋白潛在糖基化位點分布情況
Tab.3 Distribution of potential glycosylation sites of HA protein

毒株名稱8223863122126133135158165246285483NSTNGTNATNCTNESNWTNGTNSSNYTNVTNSTNGSNE/GTA/Hong Kong/4801/2014+++++++-+++++2017XN21450+++++++-+++++2017XN21483+++++++-+++++2017XN21661++++++-++++++2017XN23539+++++++-+++++2017XN23547+++++++-+++++2017XN23734++++++--+++++2017XN23828+++++++-+++++2017XN28801+++++---+++++2017XN28806++++++--+++++2017XN28812++++++--+++++2017XN30071+++++++-+++++2017XN30084+++++++-+++++2017XN30303++++++--+++++2017XN20899++++++-+-++++2017XN20929+++++++-+++++2017XN21344++++++--+++++

2.5遺傳進化分析 2017年廣州市H3N2流感病毒HA基因均屬于3C.2a分支，與當年度疫苗株A/Hong Kong/4801/2014歸屬于同一遺傳進化分支。在3C.2a分支內(nèi)部HA基因進一步進化形成3個獨立小分支，其中有3株病毒與2018-2019年度疫苗推薦株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016遺傳關系相近，共同形成3C.2a1分支，該分支主要為香港地區(qū)流行毒株，共同攜帶N21K位點突變。有8株病毒與代表株A/Beijingxicheng/1193/2016等2016年北京分離株親緣關系較近，形成同一分支。另有5株病毒與代表株A/Iowa/25/2017等2017年美國分離株親緣關系較近，形成同一分支，見圖2。

圖2 廣州市H3N2流感病毒HA基因遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza A(H3N2) virus in Guangzhou

3 討 論

世界衛(wèi)生組織從1999年開始將H3N2流感病毒列入推薦疫苗組分中，從2009年迄今已更換使用8種疫苗推薦株，以應對不斷暴發(fā)的H3N2流感流行。由于病毒基因組特點，并在疫苗的免疫壓力下，流感病毒易通過基因突變和重組，產(chǎn)生抗原漂移和轉(zhuǎn)換，以逃避疫苗的免疫保護。2012年以來的監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn)[7]，廣州市H3N2 和H1N1流感病毒交替流行，研究顯示H3N2流感也是近年來引起廣州兒童流感暴發(fā)疫情的重要病原[8]，因此開展H3N2流感病毒流行監(jiān)測和病原學研究，為及時發(fā)現(xiàn)新流感變異株、更新疫苗組分，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

HA蛋白為H3N2流感病毒表面的血凝素蛋白，分布有流感病毒的受體結合位點、抗原表位等參與病毒感染及被抗體清除的重要功能蛋白[9]，抗原位點的變異可導致病毒抗原性改變，進而逃避疫苗的免疫保護。本研究結果顯示，2017年廣州H3N2病毒在A-E區(qū)抗原位點均有不同程度突變，變異頻率較高位于A 區(qū)，與黃世騰等研究報道一致[10]，且多發(fā)生于140位、144位和150位，D區(qū)相對保守沒有發(fā)生突變。通?？乖砦粌蓚€及以上位點的突變即為新的抗原漂移[11]，本研究中有7株病毒屬于新抗原漂移，占比43.75%，提示廣州市H3N2流感在抗原性上可能發(fā)生了較大變異，與我國部分南方省份的流感流行狀況一致[12]。受體結合位點與宿主細胞表面唾液酸受體的結合決定了流感病毒的宿主嗜性，其位點改變可能會影響病毒黏附宿主上呼吸道黏膜細胞，以及病毒的抗原性及其他生物學功能[13]。本研究結果顯示，廣州市H3N2流感病毒均在受體結合位點的前壁發(fā)生突變，分別位于T131K或T135K(N)，與鹽城市H3N2流感受體結合位點變異位點不同[14]。流感病毒HA蛋白糖基化位點的增加或減少可能會影響到病毒的抗原性、致病力等其他生物學功能變化。與同年度疫苗株相比，本研究毒株糖基化位點的變化主要發(fā)生在133-NGT、126-NWT和158-NYT的缺失，和135-NSS位點增加，其中變異頻率較高的133位和135位主要位于抗原位點A區(qū)和受體結合位點的前壁，推測H3N2流感病毒的抗原性及宿主對病毒的識別可能會因此受到影響。綜上，廣州地區(qū)H3N2流感病毒HA蛋白重要氨基酸位點的變異呈現(xiàn)遺傳多態(tài)性。

2011-2015年的監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn)，廣東H3N2毒株主要分布在3C.3a分支，從2015年開始逐漸出現(xiàn)3C.2a分支[15]。本研究結果顯示，2017年廣州H3N2流感病毒均位于3C.2a分支，與同年度疫苗株A/Hong Kong/4801/2014歸屬于同一進化分支，但在該分支內(nèi)，流行毒株又進一步進化形成3個不同的小流行分支，這種分支內(nèi)的進化變異，可能是疫苗壓力選擇的結果。其中代表分支3C.2a.1是2016-2017年我國H3N2流感病毒優(yōu)勢進化分支[16]，因此2018-2019年度疫苗推薦株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016就位于該進化分支內(nèi)。進一步分析發(fā)現(xiàn)3C.2a1分支均帶有N21K突變，這種2017年起源于香港的N21K突變株，可能是2016-2017 年中國香港暴發(fā)H3N2 病毒感染并導致300 多人死亡的一個重要因素[16]，而H3N2流感病毒也是2017年廣州市流感流行的主要病原，推測與攜帶有N21K位點突變的3C.2a1分支流行有關。此外廣州流行毒株還形成另外兩個小進化分支，分別與A/Beijingxicheng/1193/2016等2016年北京分離株和A/Iowa/25/2017等2017年美國分離株親緣關系相近，提示廣州H3N2病毒進化的多樣性和復雜性。2018年開始，廣州H3N2病毒尚未引起大范圍流行，因此關于H3N2病毒的病原學研究尚缺乏相關數(shù)據(jù)，盡管2018-2019年度的疫苗推薦株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016位于3C.2a1分支，但另兩個小分支病毒是否會進一步進化，從而取代3C.2a1 分支病毒，形成新的優(yōu)勢流行毒株，從而逃避現(xiàn)有疫苗株的免疫保護，需要密切關注。

利益沖突：無