袁 杰，熊 希，李云靜，譚華炳，劉志新,3，王 婭，邱雪梅，李 蓓，楊 靖,

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)屬嗜肝性DNA病毒科，其基因組由不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)組成，長(zhǎng)約3 200對(duì)堿基[1]。HBV感染分急性和慢性感染，全球約有20億人感染過HBV，其中大約3.5億是慢性感染者。每年死于慢性乙肝(Chronic hepatitis B，CHB)引起的肝纖維化(Liver fibrosis)、肝硬化(Liver cirrhosis)及肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的人數(shù)約有78萬[2]。我國(guó)是HBV感染大國(guó)，不僅HBV攜帶者基數(shù)大(約1.2億左右)，而且HBV攜帶者極易轉(zhuǎn)化為HCC患者，每年導(dǎo)致大量的死亡病例[3]。因此，研究HBV感染導(dǎo)致HCC的分子機(jī)制對(duì)于防治病毒感染至關(guān)重要。

HBV感染與肝癌發(fā)生具有正相關(guān)關(guān)系[4]，但是學(xué)術(shù)界對(duì)于HBV病毒如何導(dǎo)致肝細(xì)胞癌化目前并沒有一致結(jié)論。目前的文獻(xiàn)資料關(guān)于此方面的闡述主要集中在3個(gè)方面：① HBV 基因組整合到宿主基因組的關(guān)鍵位置導(dǎo)致宿主基因組抑癌基因的失活或者是原癌基因基因的活化[5-7]；② HBV感染細(xì)胞造成宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌化[8-9]；③ HBV進(jìn)入細(xì)胞之后病毒 DNA編碼的結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白, 或者通過表觀遺傳導(dǎo)致宿主基因突變和染色體重排等[10-12]。

HBV在細(xì)胞中有2種存在方式，即游離型和整合型。HBV陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌患者中幾乎均可檢測(cè)到HBV基因組整合[13]。HBV 基因整合至宿主基因組中有利于其持久感染, 長(zhǎng)期的慢性炎癥可導(dǎo)致肝細(xì)胞生命周期改變和增殖, 這增加了宿主基因組DNA終端的數(shù)量, 從而有利于HBV基因組整合到宿主基因組中。在有些案例中，HBV基因組整合與肝癌發(fā)生具有一定的相關(guān)性，但是研究者仍需要更加堅(jiān)實(shí)的臨床高通量測(cè)序數(shù)據(jù)來進(jìn)行深入分析[14]。

檢測(cè)急性和慢性HBV感染者可在外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)中檢測(cè)到游離和整合的病毒基因組[15]。Shi等[16]曾報(bào)道HBV基因組特定位點(diǎn)的整合可導(dǎo)致T細(xì)胞缺陷。HBV除引起肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)之外，亦可以引發(fā)外周血淋巴細(xì)胞持續(xù)性的炎癥反應(yīng)。但是，目前仍未見報(bào)道HBV感染與血液系統(tǒng)的癌癥發(fā)生具有相關(guān)性。

HBV基因組進(jìn)入肝細(xì)胞中之后，自身也可以表達(dá)一系列的蛋白。雖然經(jīng)過幾十年的研究，很多蛋白的功能仍未能得到完整的闡釋，但有證據(jù)顯示，HBV DNA表達(dá)合成成熟的preS/S和X蛋白觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)可導(dǎo)致肝細(xì)胞惡變[17]。

近期，有研究報(bào)道HBV的表面膜蛋白preS1可促使正常肝細(xì)胞向癌化肝細(xì)胞發(fā)展[18]。在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)preS1通過抑制β-catenin的磷酸化激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)正常肝細(xì)胞向癌化肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究旨在能為HBV感染與肝癌發(fā)生的機(jī)制研究提供新的思路和線索，為未來臨床基因診斷和治療肝癌奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1臨床組織標(biāo)本 12例肝癌患者的石蠟包埋肝臟腫瘤組織標(biāo)本來源于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院病理科。其中，6 例標(biāo)本是HBsAg陽(yáng)性，6 例標(biāo)本是HBsAg陰性。肝臟腫瘤組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，修塊、脫水、浸蠟、包埋、切片，免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤切片情況，并拍照記錄。所有的人體組織材料的使用均通過湖北醫(yī)藥學(xué)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) L02肝臟細(xì)胞系，HepG2肝癌細(xì)胞系和HEK293T細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(China center for Type Culture Collection，CCTCC)，用含10%胎牛血清(Gibco Life Technologies, USA)、雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL)(Gibco Life Technologies, USA)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies, USA)，于 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.3載體構(gòu)建和引物合成 慢病毒載體pWPXLD (Addgene plasmid # 12258) 、pLKO.1-TRC (Addgene plasmid # 10878)及輔助質(zhì)粒均購(gòu)自Addgene公司。preS1基因全長(zhǎng)使用PCR擴(kuò)增后，連接入pWPXLD載體的多酶切位點(diǎn)PmeI(NEB, #R0560S)和BamHI(NEB, #R0136S)之間。根據(jù)文獻(xiàn)[18]，一段preS1 shRNAs 序列構(gòu)建入pLKO.1-TRC載體的AgeI(NEB, #R0552S)和EcoRI(NEB #R0101S)酶切位點(diǎn)之間。所有的構(gòu)建過程均參照載體說明書進(jìn)行。preS1基因PCR引物序列和shRNA序列均為華大基因合成，具體序列信息見表1。

表1 引物序列信息
Tab.1 Information of primer

引物名稱引物序列(5′-3′)退火溫度/℃引物用途preS1 FAGCTTTGTTTAAACATGGGAGGTTGGTCTTCC62載體構(gòu)建preS1 RGCGGGATCCCTTGTCATCATCGTCCTTG-TAGTCGGCCTGAGGATGACTGTCTC62載體構(gòu)建preS1 shRNA FCCGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTG-GACTCGAGTCCAACTGGTGATCGGGAAAGAATCTTTTTG—載體構(gòu)建preS1 shRNA RAATTCAAAAAGATTCTTTCCCGATCAC-CAGTTGGACTCGAGTCCAACTGGTGATCGGGAAAGAATC—載體構(gòu)建ALDH1 FAAAGAAGCTGCCGGGAAAAG58QRT-PCRALDH1 RCCCCATGGTGTGCAAATTCA58QRT-PCROCT4 FAGAACATGTGTAAGCTGCGG58QRT-PCROCT4 RGGTTCGCTTTCTCTTTCGGG58QRT-PCRSOX2 FAGCTCGCAGACCTACATGAA58QRT-PCRSOX2 RTGGAGTGGGAGGAAGAGGTA58QRT-PCRFGF20 FTTAGAGGTGTGGACAGTGGT58QRT-PCRFGF20 RAGTGCCACAAAATACCTGCG58QRT-PCRDKK1 FAGGTTCTGTTTGTCTCCGGT58QRT-PCRDKK1 RCTCCACAGTAACAACGCTGG58QRT-PCRWISP1 FGACTTTACCCCAGCTCCACT58QRT-PCRWISP1 RGTAGTCACAGTAGAGGCCCC58QRT-PCRCCND1 FGCATGTTCGTGGCCTCTAAG58QRT-PCRCCND1 RCGTGTTTGCGGATGATCTGT58QRT-PCRGAPDH FTCGTGGAAGGACTCATGACC58QRT-PCRGAPDH RATGATGTTCTGGAGAGCCCC58QRT-PCR

1.4慢病毒包裝和感染 構(gòu)建完成的慢病毒質(zhì)粒使用293T細(xì)胞系進(jìn)行包裝。每個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿，使用Lipofectamine? 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA) 轉(zhuǎn)染12 mg的目的質(zhì)粒，加上6 mg的輔助質(zhì)粒pMD2G，12 mg的輔助質(zhì)粒psPAX2。轉(zhuǎn)染后的48 h和72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清，并使用0.45 μm的微孔濾膜過濾、分裝后，于-80 ℃超低溫冰箱備用。培養(yǎng)的L02和HepG2細(xì)胞系使用包裝好的慢病毒進(jìn)行感染，并使用流式細(xì)胞術(shù)分選或是嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5免疫印跡分析 使用加入了蛋白酶抑制劑的(complete protease inhibitor cocktail, Roche, USA) RIPA裂解液裂解收集的細(xì)胞。使用Bradford蛋白定量試劑盒 (Bio-Rad, USA)對(duì)提取的總蛋白溶液進(jìn)行定量，并使用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)至NC膜(Nitrocellulose Membrane)。與相應(yīng)的一抗孵育之前，NC使用含5%脫脂奶粉和0.1%的吐溫20的PBS溶液進(jìn)行封閉。使用Bio-Rad凝膠圖像成像儀顯影，并保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，具體步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。QRT-PCR檢測(cè)使用BIO-RAD CFX96 和 SYBR RT-PCR kits (ROCHE, USA)熒光定量試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green PCR master mix，5 μL稀釋10倍的 cDNA模板和5 μL稀釋10倍的正反引物混合物。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；95 ℃，20 s，58 ℃，20 s，72 ℃，20 s，采集熒光信號(hào)，運(yùn)行45個(gè)循環(huán)；65 ℃至95 ℃繪制溶解曲線。QRT-PCR所使用的引物使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體所使用引物序列請(qǐng)見表1。

1.7免疫共沉淀 穩(wěn)定過表達(dá)帶FLAG標(biāo)簽preS1蛋白的L02-preS1細(xì)胞系使用加入了蛋白酶抑制劑的(complete protease inhibitor cocktail, Roche, USA)RIPA裂解液冰上裂解1 h。細(xì)胞裂解產(chǎn)物高速離心(15 000 g, 15 min, 4 ℃)去除未溶解的細(xì)胞碎片。收集的上清加入anti-FLAG標(biāo)簽抗體(1 μg/mL)4 ℃孵育過夜，然后再加入30 μL的可以吸附IgG的proteinA瓊脂糖珠(CST，#9863)4 ℃孵育2 h。使用RIPA溶液漂洗5～7次。然后高溫洗脫吸附的蛋白，使用SDS-PAGE或是Western-Blot進(jìn)行檢測(cè)。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩兩檢驗(yàn)采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HBV促進(jìn)肝癌發(fā)生的臨床肝癌樣本分析 通過對(duì) 6 例HBV陽(yáng)性的肝癌標(biāo)本和 6 例HBV陰性的肝癌樣本進(jìn)行石蠟切片和免疫組化染色分析，我們發(fā)現(xiàn)HBV攜帶者CD133陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞數(shù)量要多于對(duì)照組(圖1)?；趯?duì)臨床樣本的分析，我們推測(cè)HBV可以表達(dá)某些因子促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的產(chǎn)生。

2.2preS1促進(jìn)肝癌發(fā)生的細(xì)胞模型分析 近期，已有研究報(bào)道preS1可以促進(jìn)正常肝臟細(xì)胞向癌化肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)化[18]。為了進(jìn)一步深入研究preS1促進(jìn)肝細(xì)胞癌化的具體機(jī)制，我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)preS1的肝臟細(xì)胞模型。與對(duì)照組L02-GFP相比，L02-preS1細(xì)胞中癌癥細(xì)胞相關(guān)基因ALDH1、Oct4和Sox2在mRNA水平上調(diào)表達(dá)(圖2A)。在細(xì)胞模型HepG2-preS1中，我們可以得到類似的結(jié)果(圖2B)。Western-Blot結(jié)果顯示，L02-preS1和HepG2-preS1中ALDH1、Oct4和Sox2的表達(dá)水平均因?yàn)閜reS1的過表達(dá)而上調(diào)(圖2C)。以上結(jié)果證實(shí)，在肝細(xì)胞中過表達(dá)preS1可以促進(jìn)癌癥相關(guān)因子的上調(diào)表達(dá)。

圖1 肝癌病理切片免疫組化染色的顯微照相圖片F(xiàn)ig.1 A micrographic picture of immunohistochemical staining of the pathological section of liver cancer

Graphs show means±SD, n= 3；*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001.圖2 在肝細(xì)胞系L02和肝癌細(xì)胞系HepG2中穩(wěn)定過表達(dá)preS1可上調(diào)表達(dá)腫瘤標(biāo)志分子ALDH1、Oct4和Sox2Fig.2 Stable over-expression of preS1 in hepatocyte line L02 and hepatoma cell line HepG2 can up regulate the expression of tumor markers ALDH1, Oct4 and Sox2

2.3preS1促進(jìn)肝癌發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制分析 雖然已有報(bào)道preS1促進(jìn)肝癌產(chǎn)生，但是研究者對(duì)其內(nèi)在機(jī)制仍缺乏了解。我們通過免疫共沉淀技術(shù)獲取了能與preS1相互作用的蛋白。免疫共沉淀產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，主要條帶經(jīng)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)preS1與β-catenin存在相互作用(圖3A)。我們進(jìn)一步對(duì)preS1穩(wěn)定過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)細(xì)胞模型進(jìn)行QRT-PCR分析。令人意外的是，在過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)preS1之后，在mRNA水平并未檢測(cè)到β-catenin的表達(dá)變化(圖3B)。我們進(jìn)一步使用Western-Blot分析β-catenin磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示：過表達(dá)preS1之后，磷酸化的β-catenin表達(dá)量降低，而非磷酸化的β-catenin表達(dá)量升高；而使用RNA干擾下調(diào)preS1的表達(dá)量，β-catenin的磷酸化水平可以得到恢復(fù)(圖3C)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，我們使用不同濃度梯度preS1過表達(dá)質(zhì)粒(0、0.2、0.4 μg/mL)轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染48 h 之后檢測(cè)磷酸化β-catenin和非磷酸化β-catenin表達(dá)量。結(jié)果顯示：隨著preS1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度的增加，磷酸化β-catenin的表達(dá)量逐步降低，而非磷酸化的β-catenin表達(dá)量逐步升高 (圖3D)。FGF20、DKK1、WISP1和CCND1是Wnt信號(hào)通路中可以被β-catenin激活的關(guān)鍵下游基因[22]。我們結(jié)果顯示：與對(duì)照組(L02-GFP)相比，preS1穩(wěn)定過表達(dá)肝細(xì)胞系(L02-preS1)在mRNA水平上調(diào)表達(dá)FGF20、WISP1和CCND1(圖3E)。以上結(jié)果說明，preS1可以通過抑制β-catenin磷酸化，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)未磷酸化β-catenin的濃度，從而激活Wnt信號(hào)通路。

Graphs show means±SD, n=3；ns: no significant difference; *: P<0.05; **: P< 0.01.圖3 preS1通過結(jié)合β-catenin，抑制β-catenin磷酸化，從而激活Wnt信號(hào)通路 Fig.3 preS1 activates Wnt signaling pathway by binding to β-catenin and inhibiting phosphorylation of β-catenin

3 討 論

CD133作為肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物已得到研究者的公認(rèn)[19]。ALDH1、Sox2和Oct4作為細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的關(guān)鍵腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子，也廣泛用于肝癌干細(xì)胞的篩選和標(biāo)記[20]。我們對(duì)臨床肝癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，HBV攜帶者病理切片標(biāo)本中CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量要多于未感染HBV的對(duì)照組(圖1)。我們利用慢病毒技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)HBV表面膜蛋白preS1的肝細(xì)胞模型。與對(duì)照組相比，過表達(dá)preS1的肝細(xì)胞模型中ALDH1，Sox2和Oct4在mRNA水平和蛋白水平均得到了上調(diào)表達(dá)(圖2)。相對(duì)于肝癌細(xì)胞模型HepG2，在正常肝細(xì)胞模型L02中過表達(dá)preS1，肝癌細(xì)胞腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平上調(diào)更加明顯。

已有報(bào)道顯示，preS1的表達(dá)對(duì)于正常肝細(xì)胞向癌化肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化具有重要作用[18]，但是肝癌發(fā)生過程中與preS1相互作用的下游因子及信號(hào)通路仍未見報(bào)道。利用建立的L02-preS1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系，結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)我們獲取了能與preS1相互作用的蛋白。使用SDS-PAGE電泳分離之后，對(duì)主要條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析后發(fā)現(xiàn)，preS1在蛋白層面可以和β-catenin相互作用(圖3A)。我們利用慢病毒RNAi載體pLKO.1-TCR，在過表達(dá)preS1的L02細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)preS1。令我們意外的是，下調(diào)表達(dá)preS1，β-catenin在mRNA水平的表達(dá)量并沒有變化(圖3B)。隨后，我們使用Western-Blot對(duì)β-catenin的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)在L02肝細(xì)胞模型中過表達(dá)preS1，β-catenin的磷酸化水平受到抑制。而下調(diào)preS1的表達(dá)量，β-catenin的磷酸化水平可以得到恢復(fù)(圖3C)。通過不同濃度梯度的preS1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系L02，我們進(jìn)一步證實(shí)了preS1的表達(dá)可以抑制β-catenin的磷酸化，上調(diào)非磷酸化β-catenin的表達(dá)水平(圖3D)。β-catenin作為Wnt信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白，對(duì)于癌癥干細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，APC、Axin、GSK3和CKI可組成復(fù)合物，降解磷酸化的β-catenin，阻止β-catenin和轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合，抑制Wnt信號(hào)通路開啟[21]。β-catenin和轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合會(huì)激活下游基因(如FGF20，DKK1，WISP1，CCND1等)的表達(dá)[22]，從而開啟Wnt信號(hào)通路。本研究也證實(shí)過表達(dá)preS1可以抑制β-catenin的磷酸化，激活FGF20，WISP1和CCND1的表達(dá)(圖3E)。

結(jié)合已發(fā)表的研究結(jié)果[18]，并對(duì)本次的研究結(jié)果進(jìn)行分析之后，我們提出如下觀點(diǎn)：preS1與β-catenin的結(jié)合可抑制β-catenin的磷酸化，未磷酸化的穩(wěn)態(tài)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積聚，與下游TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Wnt信號(hào)通路，并促進(jìn)肝細(xì)胞癌化(圖3F)。本研究旨在能夠促進(jìn)我們對(duì)HBV導(dǎo)致的肝癌的機(jī)制理解，并未將來防治HBV引起的肝癌奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無