劉保光，汪保英，栗俞程，白 明，苗明三，許二平

肺炎克雷伯菌作為一種人獸共患條件病原菌，可引起人和多種動物感染，危害人和畜禽健康[1]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，肺炎克雷伯菌對抗生素的耐藥情況日趨嚴(yán)重，攜帶β-內(nèi)酰胺酶是該菌產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一[2]。ESBLs主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，肺炎克雷伯菌和大腸桿菌是其代表菌種[3]。而CTX-M型酶分布廣泛，是一組逐漸被認(rèn)識且成員日益龐大的ESBLs，以對頭孢噻肟高水平耐藥為主要特征[4]。該酶目前已經(jīng)成為亞洲國家如日本、韓國主要的ESBLs類型，我國也是CTX-M型酶的高發(fā)區(qū)，有研究表明，CTX-M型ESBLs可能是我國華南地區(qū)，乃至全國常見的ESBLs類型之一[5]。其中，華北地區(qū)流行的CTX-M型ESBLs主要為CTX-M-14型[6]。據(jù)報道，CTX-M型ESBLs編碼基因常位于質(zhì)粒上，該質(zhì)粒大多可以接合，還常與周圍可移動基因元件(如插入序列ISEcp1或IS903、轉(zhuǎn)座子)相關(guān)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，位于CTX-M基因周圍的可移動元件對耐藥基因的傳播起重要作用[9-10]。

目前，肺炎克雷伯菌耐藥表型和分子分型報道較為多見[11-16]，但肺炎克雷伯菌產(chǎn)CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶報道鮮見[17-19]。本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，開展產(chǎn)CTX-M-14型ESBL基因的遺傳背景研究，這對控制該型ESBLs的傳播具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 鄭州某雞場分離、經(jīng)過VITEK-32全自動鑒定儀證實、基因型鑒定的一株產(chǎn)CTX-M-14型ESBL肺炎克雷伯菌(耐藥表型及基因型鑒定另文發(fā)表[20]，標(biāo)號為F1)，E.coliC600受體菌由河南省人民醫(yī)院檢驗科惠贈。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(購自中國普通微生物菌種保存中心，陰性對照菌)；肺炎克雷伯菌ATCC700603(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陽性對照菌)。

1.1.2培養(yǎng)基 LB瓊脂、LB肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技公司。

1.1.3藥物 試驗用抗生素為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，均在有效期內(nèi)。

1.1.4試劑 普通質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN，北京)，PBR322載體、Taq酶等購自大連寶生物公司。

1.1.5儀器 Vitek-32全自動細(xì)菌鑒定儀購自法國生物-梅里埃公司，凝膠成象系統(tǒng)購自Alpha Innotech Corporation，PCR擴(kuò)增儀購自美國Thermocycler2720。

1.2 方 法

1.2.1CTX-M-14型ESBL基因的質(zhì)粒接合傳遞試驗

1.2.1.1供體菌(標(biāo)號F1)與受體菌(E.coliC600)接合 用LB平板分離培養(yǎng)F1菌株和E.coliC600(受體菌對利福平耐藥)，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑培養(yǎng)的供體菌和受體菌的單菌落分別接種入5 mL的LB肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)的供體菌和受體菌各50 μL同時加到5 mL LB肉湯中混勻，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.1.2陽性接合子的篩選與確認(rèn) 1)取100 μL接合菌液(剩余菌液4 ℃保存)及只含受體菌、供體菌的對照菌液分別接種于LB平板(含160 μg/mL利福平和20 μg/mL頭孢噻肟)，37 ℃過夜培養(yǎng)；2)接合菌液在利福平和頭孢噻肟上述濃度耐受的平板上能生長，生長的菌落即為陽性接合子；而對照菌液在利福平和頭孢噻肟上述濃度耐受的平板上不生長。

1.2.1.3陽性接合子的的MIC值檢測 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[21]，分別測定阿莫西林(AMX)等20種藥物對接合子及E.coliC600的最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.1.4陽性接合子的PCR檢測 對篩選出的陽性接合子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，分別用以下blaCTX-M、blaTEM、blaSHV及blaACT特異性引物，PCR反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)[20]，PCR擴(kuò)增后分別取8 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，凝膠成像觀察結(jié)果。

1.2.2 CTX-M-14型ESBL的基因環(huán)境

1.2.2.1接合子質(zhì)粒雙酶切 對篩選出的含有CTX-M-14基因的陽性接合子用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行抽提，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)，紫外投射儀下觀察結(jié)果，確認(rèn)接合子質(zhì)粒存在后用BamHI和SalI雙酶切。雙酶切反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)體系為接合子質(zhì)粒7 μL，水8 μL，10×Buffer 4 μL，BamHI 3 μL，SalI 3 μL，混勻并離心，37 ℃水浴酶切3～4 h，經(jīng)0.6%瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)，用凝膠成像攝相。

1.2.2.2PBR322克隆載體雙酶切 PBR322載體用BamH I和SalI2個限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。雙酶切反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)體系為載體質(zhì)粒8 μL，水7 μL，10×Buffer 4 μL，BamH I 3 μL，SalI 3 μL，混勻并離心，37 ℃水浴酶切3～4 h，獲得載體質(zhì)粒酶切片段，經(jīng)0.6%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀下觀察結(jié)果并攝相。

1.2.2.3連接轉(zhuǎn)化 酶切后的接合子質(zhì)粒片段與酶切后的PBR322載體連接，體系為：接合子質(zhì)粒片段6 μL，PBR322載體2 μL，10×Buffer 1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中然后涂于含頭孢噻肟鈉(20 μg/mL)、氨芐西林(50 μg/mL) 及各含42 μL X-gal、IPTG及的LB固體培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)篩選。

1.2.2.4陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及雙酶切鑒定 無菌條件下，用牙簽挑取白色的單個菌落(即陽性轉(zhuǎn)化子)接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)，再次抽提重組質(zhì)粒，所提質(zhì)粒用BamH I和SalI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6%瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)，紫外投射儀下觀察結(jié)果并攝相。

1.2.2.5陽性轉(zhuǎn)化子的MIC值檢測 根據(jù)CLSI推薦的方法[21]，分別測定阿莫西林(AMX)等20種藥物對陽性轉(zhuǎn)化子的最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.2.6核苷酸序列測定與分析 接合子質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化克隆及鑒定后得到轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后其菌液送大連寶生物公司用M13通用引物Primer Walking測序(包括CTX-M-14基因，并向其上下游連續(xù)測序)，把測的3段基因序列拼為一段完整序列，結(jié)果用BioXM 2.6軟件分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST工具進(jìn)行同源序列比較。

1.2.2.7CTX-M-14型基因上下游分析 根據(jù)測序結(jié)果，分析CTX-M-14基因的上游序列及下游序列，對比CTX-M-14基因片段與原菌株測序結(jié)果有無差異。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒接合傳遞試驗結(jié)果 接合子PCR擴(kuò)增顯示，blaCTX-M及blaTEM基因呈現(xiàn)陽性，結(jié)果見圖1，而受體菌表現(xiàn)為陰性，說明blaCTX-M及blaTEM基因能通過接合試驗傳遞；用blaACT型特異性引物擴(kuò)增接合菌表現(xiàn)為陰性，說明該基因不能與blaCTX-M及blaTEM等基因同時被接合。

注: 1為Marker 2000; 2為TEM型PCR產(chǎn)物; 3為CTX-M型PCR產(chǎn)物; 4為陰性對照。圖1 接合菌PCR產(chǎn)物凝膠電泳 Fig.1 Gel electrophoresis of the zygomycetes PCR products

2.2接合子質(zhì)粒及PBR322載體雙酶切結(jié)果 陽性接合子及PBR322克隆載體抽提質(zhì)粒后用BamH I和SalI雙酶切獲得相應(yīng)的質(zhì)粒酶切片段，酶切后結(jié)果如圖2。

注: 1為Marker 19329; 2為接合子質(zhì)粒雙酶切圖; 3為PBR322載體雙酶切圖。圖2 接合子質(zhì)粒及PBR322載體質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis picture of the conjugal and PBR322 plasmids digested by two restriction enzymes

注: 1為Marker 19329; 2為陰性對照; 3為陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切圖。圖3 陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切電泳圖Fig.3 Electrophoresis picture of the transformant plasmids digested by two restriction enzymes

2.3陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切鑒定結(jié)果 篩選的陽性轉(zhuǎn)化子抽提重組質(zhì)粒用BamH I和SalI進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3。

2.4耐藥表型的測定結(jié)果 通過測定供體菌、含CTX-M-14基因片段的陽性接合子及篩選的陽性轉(zhuǎn)化子對阿莫西林、阿莫西林+克拉維酸、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星及阿米卡星等藥物的耐藥表型，分析各菌株對各種藥物的敏感性，見表1。供體菌對利福平敏感，而接合子對利福平耐藥，原因在于接合子具有受體菌對利福平耐藥的特性。接合子的其余耐藥表型與供體菌保持一致，具有供體菌相似的耐藥表型。在含頭孢噻肟平板上篩選的含CTX-M-14基因片段的陽性轉(zhuǎn)化子對頭孢噻肟耐藥，而對其余的大多數(shù)藥物表現(xiàn)敏感。

表1 供體菌、陽性接合子及轉(zhuǎn)化子對多種抗菌藥物的敏感性
Tab.1 Susceptibility of the various types of strains to varieties of antimicrobial agents

抗菌藥物MIC/(μg/mL)F1C600F1陽性接合子含CTX-M-14基因的轉(zhuǎn)化子阿莫西林AMX>1284>128128 阿莫西林/克拉拉酸(4:1)無412832氨芐西林AM>1288>128128氨芐西林+舒巴坦AM/SU(2:1)12883232頭孢噻肟鈉CTX64<0.06256464頭孢曲松CRO64<0.062564<0.0625頭孢噻呋CTF16無無0.5亞胺培南IMI<0.0625無無無頭孢吡肟CPM1無無無粘菌素COM<0.06250.1250.25<0.0625恩諾沙星ENF16無無無環(huán)丙沙星CIP16132<0.0625左氟沙星LVF32116<0.0625氟苯尼考FLO321640.5多西環(huán)素DOX320.25321阿米卡星 AK640.5128<0.0625磷霉素FOS>1282>128<0.0625新霉素NEO320.1250.5<0.0625慶大霉素GM1280.25128無利福平 RIF8>1281284

2.5轉(zhuǎn)化子核苷酸序列測定結(jié)果 經(jīng)測序，通過DNASTAR軟件把所得CTX-M-14及其上下游序列進(jìn)行拼接，拼接出2 637 bp的基因序列，將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，包含上游序列ISEcp1、下游序列IS903及完整的CTX-M-14基因開放閱讀框等移動元件，序列號為HQ650134，其基因序列如圖4。

2.6含CTX-M-14型ESBL的基因上下游分析 測序結(jié)果經(jīng)比對，測出2 637 bp的基因序列，其中包括上游序列ISEcp1tnpA、-35區(qū)和-10區(qū)、重復(fù)序列IRR、876 bp的CTX-M-14基因開放閱讀框及下游序列IS903和IRL，見圖5。

圖5 CTX-M-14型ESBL基因的基因環(huán)境結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Genetic environment structure picture of CTX-M-14 gene β-lactamase

Sbjct 1TTATCAGCTTTTATGACTCGATATATGGTAAAATAATAGTAAGAAAAGTAGTAAAAAGGG60Sbjct 61GTTCTAATTATGATTAATAAAATTGATTTCAAAGCTACGAATCTAACATCAAATGCAGGT120→ISEcp1(70-1332 bp)Sbjct 121………………………………………………………………………………………………………………1320Sbjct 1321TGTCTGGTATAATAAGAATATCATCAATAAAATTGAGTGTTGCTCTGTGGATAACTTGCA1380ISEcp1←Sbjct 1381GAGTTTATTAAGTATCATTGCAGCAAAGATGAAATCAATGATTTATCAAAAATGATTGAA1440-35區(qū)Sbjct 1441AGGTGGTTGTAAATAATGTTACAATGTGTGAGAAGCAGTCTAAATTCTTCGTGAAATAGT1500-10區(qū)Sbjct 1501GATATTTGAAGCTAATAAAAAACACACGTGGAATTTAGGGAATACTGATGTAACACGGAT1560IRRSbjct 1561TGACCGTATTGGGAGTTTGAGATGGTGACAAAGAGAGTGCAACGGATGATGTTCGCGGCG1620→blaCTX-M-14 ORF(876 bp)Sbjct 1621………………………………………………………………………………………………………………2400Sbjct 2401GAGAGCCGCCGCGATGTGCTGGCTTCAGCGGCGAGAATCATCGCCGAAGGGCTGTAACTG2460blaCTX-M-14 ORF←→IS903Sbjct 2461GTTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGTATCTTCCCGA2520 IRLSbjct 2521CAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAATAGTTCAAAATCACCAACTGGCCCACCTACAA2580Sbjct 2581TAAAGCCCTCATCAAGCGTGGCTCCATAACTTTCTGGCTGGATGATGAAGCTATTCA ?2637IS903(2460->2637 bp)←

圖4 基因序列
Fig.4 Gene sequence

3 討 論

據(jù)報道，肺炎克雷伯菌容易把耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給大腸埃希菌C600，表明介導(dǎo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移在不同種屬的細(xì)菌之間具有一定的通用性[22]。據(jù)報道，攜帶CTX-M-14基因的質(zhì)粒大多含有多重耐藥基因，表現(xiàn)出對多種抗生素的耐藥特征，具有更多的傳播機(jī)會[20]。本研究發(fā)現(xiàn)供體菌同時含CTX-M-14、SHV-11、TEM-1及ACT-like等基因，但質(zhì)粒接合試驗及接合菌PCR擴(kuò)增表明這些基因并不同時存在1個質(zhì)粒上。該試驗中CTX-M和TEM基因可以通過質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，但是ACT基因不能和CTX-M及TEM基因同時轉(zhuǎn)移，這說明ACT基因可能存在于不同質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，有些質(zhì)粒能通過質(zhì)粒接合試驗進(jìn)行轉(zhuǎn)移，有些質(zhì)粒不能進(jìn)行轉(zhuǎn)移，說明這些細(xì)菌的耐藥基因存在于不可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，細(xì)菌之間可以通過質(zhì)粒接合傳遞耐藥基因及耐藥性，這是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的重要原因之一。

藥物敏感性試驗表明，供體菌對青霉素類、三代頭孢菌素類、氨基糖苷類及阿米卡星均耐藥，而只對碳青酶烯類的亞胺培南和四代頭孢菌素類頭孢吡肟表現(xiàn)敏感，這體現(xiàn)了ESBLs和AmpC酶結(jié)合的效果，這與管希周等[23]研究報道一致。供體菌還表現(xiàn)對利福平敏感，而接合子對利福平耐藥，原因在于接合子具有受體菌對利福平耐藥的特性。接合子的其余耐藥表型與供體菌基本一致，具有與供體菌相似的耐藥表型，僅有個別藥物的MIC值較供體菌降低。另外，具有臨床意義的是供體菌把對三代頭孢菌素的耐藥性，轉(zhuǎn)移給了受體菌E.coliC600，預(yù)示耐藥性的橫向傳播以及暴發(fā)流行的可能。含CTX-M-14基因的陽性轉(zhuǎn)化子對頭孢噻肟耐藥，而對其余的大多數(shù)藥物表現(xiàn)敏感，這與朱恒乾等[24]報道一致。本試驗中，接合子均具有ESBLs的表型，這顯示該接合子在產(chǎn)生TEM型基因的同時一定產(chǎn)生其它類型的ESBLs(如SHV型、CTX-M型等)，因為受體菌E.coliC600本身不存在對β-內(nèi)酰胺類耐藥的其它機(jī)制。另外，該接合子PCR檢測結(jié)果也支持了這點。接合子中的TEM型和CTX-M型基因是由產(chǎn)ESBLs供體菌通過接合傳遞而來，揭示臨床菌株通過接合試驗在編碼ESBLs基因的水平傳播，導(dǎo)致了ESBLs菌株的流行。因此，臨床應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測、深入研究其耐藥機(jī)制，對于減緩耐藥性的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，在blaCTX-M-14基因的上游存在插入序列ISEcp1，據(jù)有關(guān)研究，該插入序列已在肺炎克雷伯菌、變形菌和沙門菌等多種腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)[25]。Eckert等[26]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)blaCTX-M-14基因的上游均存在插入序列ISEcp1，同時其余CTX-M型ESBLs基因的上游也大多發(fā)現(xiàn)插入序列ISEcp1。本研究還發(fā)現(xiàn)，在blaCTX-M-14基因的下游存在插入序列IS903，在blaCTX-M-14基因的上游和下游均存在反向重復(fù)序列IRR和IRL，且在blaCTX-M-14基因的上游與反向重復(fù)序列IRR間有42 bp的間隔，在blaCTX-M-14基因下游的反向重復(fù)序列IRL中發(fā)現(xiàn)了公認(rèn)的啟動元件-35區(qū)，推測可能是對其下游基因表達(dá)的一種機(jī)制。Eckert等[26]發(fā)現(xiàn)，5株產(chǎn)blaCTX-M-14基因的下游有4株顯示存在插入序列IS903。據(jù)Diestra等[27]發(fā)現(xiàn)，含blaCTX-M-14基因的周圍環(huán)境區(qū)域高度保守，發(fā)現(xiàn)blaCTX-M-14基因的上下游分別出現(xiàn)插入序列ISEcp1和IS903。據(jù)Lartigue等[28]報道，在blaCTX-M-14基因的上下游也分別出現(xiàn)ISEcp1和IS903，但在blaCTX-M-14基因的上游與反向重復(fù)序列IRR間有43 bp的間隔，這與本研究發(fā)現(xiàn)的42 bp間隔有差異?？梢?，ISEcpl和IS903在blaCTX-M-14基因的傳播中具有重要作用，除了能介導(dǎo)blaCTX-M-14基因從染色體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒外，也可使blaCTX-M-14基因在不同的質(zhì)粒之間進(jìn)行傳播。

利益沖突：無