蘇來金，趙 峰，馬麗萍，周德慶

諾如病毒(Noroviruses, NoVs)屬于杯狀病毒科(Calicivirida)，諾如病毒屬(Norovirus)，是一種重要的食源性病原菌，引發(fā)了許多傳播與暴發(fā)[1-3]。NoVs可分為5個(gè)遺傳組(genogroups, G)，分別被命名為GI到GVII，其中GI、GII和GIV感染人類[4-5]。貝類通過濾食作用可將諾如病毒持續(xù)富集在體內(nèi)，成為NoVs傳播的重要載體[6]，在貝類中經(jīng)常污染到GI、GII 2種基因群的NoVs[7-10]，目前檢測NoVs的分子生物學(xué)方法包括：RT-PCR[11]，巢式RT-PCR[12]，熒光定量RT-PCR[13]等方法，也有同時(shí)檢測GI、GII NoVs的檢測方法[14-16]，然而不同基因群的NoVs鑒定一般需要有多對引物分別檢測，甚至還需要對擴(kuò)增產(chǎn)物回收、測序鑒定、操作繁瑣、耗時(shí)較長。

本研究通過對比分析GI、GII NoVs流行株的基因序列，篩選一對引物對GI、GII NoVs同時(shí)檢測，根據(jù)Synergy brands(SYBR) Green I 熒光定量中熔解曲線特性[17-18]，建立了基于SYBR Green I熒光定量熔解曲線分析的快速分群方法，旨在為貝類中單基因群或混合型基因群NoVs的快速檢測與分群分型提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 6株陽性NoVs分別為57397毒株(GI.1型，GenBank:M87661.2)，54108毒株(GI.3型， GenBank: GQ856470.1), 55063毒株(GI.6型，GenBank: GQ856464.), 57395毒株(GII.4型，GenBank:KC752514),F278毒株(GII.12型，GenBank NO:JQ899442), GZ2013-L20毒株(GII.17型，KR869038)為中國疾病預(yù)防控制中心提供，為感染病人的糞便樣品，經(jīng)濃縮冷凍保存，基因型別均經(jīng)過擴(kuò)增測序后，使用美國CaliciNet諾如病毒在線分型工具(https://norovirus.phirearchlab.org/)進(jìn)行分型確認(rèn)；輪狀病毒(Rotavirus，RV)、星狀病毒(Astrovirus，AstV)為實(shí)驗(yàn)室保存的病毒cDNA，由青島市疾控中心提供。用于人工污染的貝類樣品為青島城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場采集的鮮活牡蠣，經(jīng)過檢測未發(fā)現(xiàn)NoVs檢出。貝類檢測樣品為2015年1-12月從青島城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場采集的牡蠣、扇貝、毛蚶、菲律賓蛤仔、中國蛤等5種貝類，每月采集2次，全年共采集120份樣品。

1.2設(shè)備與試劑 NanoPhotometerTM微量核酸蛋白測定儀，購自德國IMPLEN公司；羅氏Light Cycler? 2.0全自動(dòng)熒光定量PCR儀，購自德國Roche公司；Sigma 1-14冷凍離心機(jī)，購自德國SIGMA公司；Biometra PCR儀，購自德國Biometra公司；DYCP-31E型電泳儀，購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，購自法國Vilber Lourmat公司； High Pure Viral RNA Kit 、蛋白酶K購自德國羅氏(Roche)公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京天根(TIANGEN)公司，DNaseI(RNase Free)、SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒等購于大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.3引物篩選 從GenBank下載目前用于分群分型的主要毒株GI(GeneBank NO:M87661、L07418、AB447414、AB042808、KJ402295、AB081723、MH130046、AF538679、KF586507、M0127530)、GII(GeneBank NO. U07611、DQ366347、JQ751034、AB220924、AB220921、 AY032605、EF126965、HM802544、AB294779、AB933767、AB434770、JX459908、DQ078829、 AY682550、AB684664、JX846926、AB039780、AY038599、AB126320、 AJ277618、 JN899242、 GU017903、 AY502010、 LC037415、AY823304、 AY823306、 EU275779、 JN899245、AB233471、MG495080、MG495085、 GQ856469、 KU306738)NoVs的基因序列，利用DNA star進(jìn)行序列比對，篩選GI、GII同時(shí)保守區(qū)域的引物，最終選擇同時(shí)檢測GI、GII NoVs的引物為：上游引物P290： 5′-GATTACTCCAGGTGGGAYTCMAC-3′(引物位置：4568-4 590),下游引物P289：5′-TGACGATTTCATCATCACCRTM-3′(引物位置：4865-4886),擴(kuò)增片段大小319 bp。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1病毒人工污染、回收、RNA提取 取2 g牡蠣消化道樣品，加入10 μL的病毒原液，加入2 mL PBS緩沖液，勻漿2 min；NoVs回收按照實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[19]，RNA提取使用High Pure Viral RNA Kit(Roche)試劑盒說明方法進(jìn)行。

1.4.2普通RT-PCR與熒光定量反應(yīng)體系優(yōu)化 cDNA合成擴(kuò)增體系為50 μL，5 μL 10×Buffer，8 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 10 mmol/L dNTPs，2 μL P289引物，0.7 μL 10 U/μL AMV-RT 反轉(zhuǎn)錄酶，0.2 μL 50 U/μL RNasin，2 μL病毒RNA模板，補(bǔ)足去離子水，42 ℃反應(yīng)1 h。

PCR反應(yīng)：5 μL 10×Buffer，4 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 mmol/L dNTPs，上下游引物各1 μL，0.5 μL 5 U/μL Taq酶，8 μL cDNA，補(bǔ)足去離子水，反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，然后94℃ 1 min，49℃ 1 min 20 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。產(chǎn)物電泳后經(jīng)測序進(jìn)行鑒定。

熒光定量的PCR采用20 μL的體系進(jìn)行擴(kuò)增，SYBR? premix Ex TaqTM II (2×) 15 μL，2條引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板100 ng左右，補(bǔ)足去離子水。熒光定量PCR擴(kuò)增: 95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；然后95 ℃變性5 s，49 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)。

1.4.3熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品制備 使用GII.4型NoV的RNA為擴(kuò)增對象，RT-PCR產(chǎn)物電泳切取特異性條帶，用膠回收試劑盒回收后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室方法制備質(zhì)粒[20]，并提取DNA，用生物分光光度計(jì)測定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，換算成拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋，作為系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法建立。

1.4.4SYBR Green I熒光定量PCR的TM曲線 熔解曲線分析按照熒光定量試劑盒說明書中推薦的程序，以0.1℃/s變化速度從65℃升高至95℃繪制熔解曲線。

1.4.5特異性與準(zhǔn)確性試驗(yàn) 使用GI.1、GI.3、GI.6、GII.4、GII.12、GII.17等6株陽性NoVs，以輪狀病毒(RV)、星狀病毒(AsTV)為陰性對照，以二次水為空白對照，對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定檢測方法的特異性和準(zhǔn)確性。

1.4.6穩(wěn)定性與重復(fù)性 將不同型別的NoVs，人工污染貝類后，分3個(gè)時(shí)間批次利用熒光定量PCR熔解曲線法測定Tm值，然后，計(jì)算3個(gè)批次樣品的Tm平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)以及對Tm值進(jìn)行方差分析，確定方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.4.7驗(yàn)證性試驗(yàn) 對采集的120個(gè)貝類樣品，利用建立的方法，結(jié)合普通RT-PCR，對檢測出的陽性NoVs，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段回收、測序分析，與熔解曲線檢測結(jié)果對比，驗(yàn)證方法的實(shí)用性。

1.5數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，數(shù)據(jù)處理使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增、熔解曲線使用羅氏Light Cycler? 2.0全自動(dòng)熒光定量PCR儀自帶軟件自動(dòng)生成。

2 結(jié) 果

2.1普通RT-PCR結(jié)果 使用P289和P290引物，對6株NoVs陽性樣品進(jìn)行普通RT-PCR擴(kuò)增。由圖1擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖可知：P289/P290引物可以特異性擴(kuò)增GI和GII NoVs陽性毒株，不能擴(kuò)增RV和AstV，說明引物特異性良好，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期319 bp相符，反應(yīng)干擾少，說明擴(kuò)增反應(yīng)準(zhǔn)確。

備注：從左到右M為DL2000 maker，1-2為 GI.1；3-4為GI.3；5-6為GI.6；7-8為GII.4；9-10為GII.12；11-12為GII.17；13-14為RV；15-16為AstV；17為空白對照圖1 不同型別諾如病毒的普通RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of different genotype NoVs

2.2熒光定量檢測 從圖2可以看出，在病毒標(biāo)準(zhǔn)品為102～109copies范圍內(nèi)，熒光定量擴(kuò)增曲線具有良好的擴(kuò)增，RV、AstV和空白對照均沒有擴(kuò)增，說明反應(yīng)特異性良好；從圖3可以看出，在病毒標(biāo)準(zhǔn)品為103～109copies范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線性關(guān)系良好(R2=0.993，P<0.01)，說明定量反應(yīng)準(zhǔn)確。

從左到右A-H分別為3.5×109，3.5×108，3.5×107，3.5×106，3.5×105，3.5×104，3.5×103，3.5×102 copies的諾如病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，I，J，K分別為RV，AstV和空白對照圖2 熒光定量反應(yīng)擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of fluorescence quantitative reaction

從左到右A-G分別為3.5×109，3.5×108，3.5×107，3.5×106，3.5×105，3.5×104，3.5×103 copies的NoVs質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品圖3 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of fluorescence quantitative

2.3準(zhǔn)確性和特異性 6株不同型別的NoVs陽性樣品經(jīng)過SYBR Green I法熒光定量PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行熔解曲線分析。由圖4可以看出，GI諾如病毒和GII諾如病毒擴(kuò)增曲線可以明顯區(qū)分，其中GI諾如病毒對應(yīng)的Tm值在85 ℃左右，GII諾如病毒對應(yīng)的Tm值在86 ℃左右，區(qū)分度明顯，型別鑒別與實(shí)際樣品型別相符，輪狀病毒、星狀病毒和空白對照均無擴(kuò)增曲線，也無Tm值，說明反應(yīng)特異性良好。6株不同型別的NoVs陽性樣品的熔解曲線Tm值與區(qū)分度情況見表1。可以看出，GI諾如病毒的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.35，t2=0.59，t3=0.23,P>0.05)，GII諾如病毒的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.35，t2=0.18，t3=0.18,P>0.05)，GI諾如病毒的Tm值為85.15±0.02，GII諾如病毒的Tm值為86.06±0.01，兩組基因群之間進(jìn)行方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7507.60,P<0.05 )，因此，通過Tm值不能區(qū)分GI或GII同一基因群內(nèi)的不同型別，但可以用來區(qū)分GI和GII基因群間的NoVs。

圖4 不同型別諾如病毒的熔解曲線分析Fig.4 Analysis of dissolution curve of Norovirus different genotype NoVs

表1 不同型別諾如病毒Tm值分析
Tab.1 Analysis of Tm value of different genotype NoVs

基因型Tm 值GI.185.13±0.11aGI.385.15±0.08aGI.685.16±0.05aGII.486.07±0.04bGII.1286.05±0.06bGII.1786.06±0.05b

注：Tm值兩兩比較，同列數(shù)字后字母不同表示比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，字母相同表示比較后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4方法的穩(wěn)定性 將6株不同型別的陽性NoVs人工污染牡蠣后，分3個(gè)時(shí)間批次利用熒光定量PCR熔解曲線法測定Tm值，計(jì)算3個(gè)批次樣品的Tm平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)。從表2中可以看出，對3個(gè)檢驗(yàn)批次NoVs的Tm值均沒有較大變化，RSD均小于0.1%，GI和GII NoVs的Tm平均值方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2162.25,P<0.05)，GI.1組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.08，t2=0.40，t3=0.32,P<0.05)，GI.3組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.34，t2=1.80，t3=1.46,P<0.05)，GI.6組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.43，t2=0.22，t3=0.22,P<0.05)，GII.4組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.81，t2=2.00，t3=0.49,P<0.05), GII.12組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.10，t2=0.28，t3=0.38,P<0.05), GII.17組內(nèi)不同批次的Tm值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=0.59，t2=1.33，t3=0.74,P<0.05)，上述結(jié)果表明建立的鑒別方法穩(wěn)定性強(qiáng)，具有良好的重現(xiàn)性。

2.5樣品中諾如病毒檢測與鑒定 對2015年1-12月采集的不同貝類樣品中NoVs的檢測，并利用本研究建立的方法、RT-PCR擴(kuò)增后測序鑒定方法進(jìn)行比較。從表3中可以看出，120份貝類樣品中共有7個(gè)樣品檢出了NoVs陽性結(jié)果，檢出率為5.83%，其中有2份樣品(牡蠣和毛蚶)中出現(xiàn)了2個(gè)Tm值，說明這兩份樣品同時(shí)存在GI和GII NoVs，其他樣品均出現(xiàn)1個(gè)Tm值，說明這些樣品存在單一類型的NoVs。經(jīng)過測序鑒定與本方法的結(jié)論進(jìn)行比對，7個(gè)樣品的判定結(jié)論均一致，說明本研究建立的方法適合貝類中GI和GII NoVs的快速檢測與鑒定分群。

3 討 論

國際上按照NoVs基因組聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)的序列，將NoVs被分為5個(gè)基因組(Genogroups)[21]，其中GI和GII以及GIV NoVs感染人類[22-23]。根據(jù)NoVs的核苷酸序列，GI和GII NoVs可進(jìn)一步分為8和17個(gè)基因型(Genetic Cluster 或Genotype)[24]。近年來，NoVs的基因重組和變異的不斷出現(xiàn)，GI和GII NoVs 進(jìn)一步分為9個(gè)和29個(gè)基因型。對幾個(gè)NoVs全長基因組序列的分析表明，同一基因群內(nèi)不同病毒株的核苷酸序列同源性為69%～97%，而不同基因群的病毒株核苷酸序列同源性只有51%～56%[25]，這為本研究利用核苷酸序列開展不同基因群間的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

貝類引起的NoVs疫情暴發(fā)中，有1個(gè)顯著的特點(diǎn)是在感染者和受污染的貝類中可以檢測出多個(gè)型別的NoVs，盡管針對混合基因型NoVs的多重檢測方法已經(jīng)建立[26-27]，但卻無法快速分群分型，傳統(tǒng)的分群分型方法仍然以基因擴(kuò)增、測序、比對分析為主，耗時(shí)較長，尤其在貝類中NoVs含量低、型別復(fù)雜、存在樣品成分干擾等情況下，NoVs快速檢測和分群分型就顯得尤為迫切。因此，如何快速地確定貝類中NoVs污染的基因群類別，對于追溯污染的貝類、發(fā)布NoVs疫情預(yù)警等具有重要的意義。本研究探索分析了目前流行的NoVs毒株及參考分群分型毒株的基因序列，篩選了可以同時(shí)檢測GI、GII基因群的引物，建立了基于SYBR Green I 熒光定量檢測及擴(kuò)增熔解曲線分析方法，用陽性樣品和實(shí)際貝類樣品進(jìn)行檢測驗(yàn)證，均與測序方法得到的分型結(jié)果一致，該方法既可以實(shí)現(xiàn)定量檢測，又可以快速分群，為貝類中NoVs快速檢測和分群分型提供了技術(shù)支撐。

表2 不同檢驗(yàn)批次諾如病毒的Tm值
Tab.2 Results of different test batches for Norovirus’ Tm

樣品Tm值 GI.1GI.3GI.6GII.4GII.12GII.17A185.2385.0985.2286.0486.0386.08A285.1285.1285.0186.0386.0686.05A385.1585.1485.1986.0986.0586.13B185.0985.1185.0886.1186.0286.08B285.2185.0885.1286.0886.0586.09B385.1985.1985.1486.1286.0886.05C185.1385.1885.1986.0185.9886.04C285.1585.1685.1186.1386.0286.06C385.1785.1185.0886.2686.1186.07平均值85.16b85.13b85.13b86.10a86.04a86.07a標(biāo)準(zhǔn)差0.080.050.040.070.040.03相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)0.090.050.050.080.040.03

注：A、B、C分別代表不同的檢驗(yàn)批次，對不同型別NoVs的Tm值的平均值進(jìn)行兩兩比較，同行數(shù)字后字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，字母相同表示比較后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 陽性樣品的檢測與基因群鑒定
Tab.3 Detection and genogroups identification of positive samples

月份樣品Tm1 Tm2 本方法測序方法一致性1月牡蠣85.1486.09GI,GIIGI,GII是2月扇貝85.12-GIGI是2月牡蠣-86.07GIIGII是3月毛蚶85.1186.07GI,GIIGI,GII是11月菲律賓蛤仔-86.08GIIGII是12月牡蠣85.16-GIGI是12月扇貝-86.07GIIGII是

備注：-表示未檢出。

利益沖突：無