李珺沬， 趙 甜， 劉 巖， 劉圓呈， 魯雅潔， 蔣 曄*

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017)

黃曲霉毒素(Aflatoxins)具有高毒性和高致癌、致畸、致突變性，它們對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物危害極大[1 - 2]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)相似且特征已知的黃曲霉毒素類(lèi)化合物。其中，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2是主要的毒性物質(zhì)[3 - 4]。目前，對(duì)于黃曲霉毒素的研究主要集中于食品和農(nóng)畜產(chǎn)品[5 - 6]，而對(duì)中藥材中黃曲霉毒素的相關(guān)研究報(bào)道較少。中藥材在加工、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，很容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生或被黃曲霉毒素污染[7 - 8]。同時(shí)，由于黃曲霉毒素不溶于水，并且耐熱性很高，加熱到280 ℃才能發(fā)生裂解破壞[9]。因此，測(cè)定中藥材、中藥飲片和中藥制劑中的黃曲霉毒素對(duì)保證用藥安全具有重要的意義。目前，黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[10]、薄層色譜法[11]、熒光分光光度法[12]、免疫親和柱-高效液相色譜法[13]等。但是這些方法存在穩(wěn)定性差、假陽(yáng)性較多、特異性差、靈敏度低等弊端。

攪拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE)是一種集萃取、富集、凈化為一體的新型樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、溶劑用量少、富集倍數(shù)高和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[14 - 16]。氧化石墨烯具有較高的比表面積和豐富的含氧官能團(tuán)，近年來(lái)以氧化石墨烯作為吸附材料，被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境污染物等的前處理研究[17 - 18]。本研究通過(guò)制備多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物為涂層的攪拌棒，并用該攪拌棒萃取中藥材陳皮中的黃曲霉毒素，同時(shí)結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為中藥中黃曲霉毒素的測(cè)定提供了一種有效的分析手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

L-6200A高效液相色譜儀(日本，Hitachi公司)；2475熒光檢測(cè)器(美國(guó)，Waters公司)；柱后衍生系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；DF-11集熱式磁力攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)；HGC-24型氮吹儀(天津恒高技術(shù)有限公司)；H1650臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；TYD-300超聲清洗器(北京泰元達(dá)創(chuàng)公司)。

黃曲霉毒素(AF)對(duì)照品溶液(美國(guó)Sigma公司)；多巴胺(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；氧化石墨烯水分散液(濟(jì)寧利特納米技術(shù)有限責(zé)任公司)；碘(濟(jì)南蕭試化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；所有其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

1.2.1 對(duì)照品溶液精密量取AF B1、AF B2、AF G1、AF G2對(duì)照品溶液適量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度分別為200、50、200、50 ng/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2 樣品溶液精密稱(chēng)取已粉碎并過(guò)二號(hào)篩的陳皮樣品粉末約1 g，置于10 mL離心管中，加入0.2 g NaCl，精密加入70%甲醇溶液5 mL[19]，超聲5 min，于2 500 r/min離心5 min，精密將取上清液1 mL，置于10 mL西林瓶中，加超純水稀釋至10 mL，備用。

1.3 攪拌棒的制備

參考文獻(xiàn)方法[18 - 20]制備攪拌棒。具體方法如下：取含磁子的四氟攪拌棒，置于含2 mg/mL多巴胺的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)的燒杯中，于30 ℃磁力攪拌水浴鍋中緩慢勻速攪拌12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min，將攪拌棒置于2 mg/mL的氧化石墨烯水分散液中，于65 ℃磁力攪拌水浴鍋中反應(yīng)12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min。重復(fù)以上操作步驟3次，得到具有一定多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層厚度的攪拌棒。

1.4 攪拌棒吸附萃取過(guò)程

將自制的攪拌棒置于“1.2.2”項(xiàng)下制備的樣品溶液中，在磁力攪拌水浴鍋中萃取(溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min)20 min，取出攪拌棒，于2 mL甲醇中解吸(攪拌速率為300 r/min)2 min，解吸液于45 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，并?.1 mL色譜流動(dòng)相復(fù)溶后，用于高效液相色譜分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水=40∶18∶42(V/V/V)；流動(dòng)相流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測(cè)：λex=360 nm，λem=450 nm；衍生溶液：0.05%碘溶液，流速：0.3 mL/min；衍生溫度：70 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌棒涂層厚度的考察

圖1 涂層厚度對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of coating thickness on extraction efficiency

攪拌棒的涂層厚度對(duì)萃取效率具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)考察了在含磁子的四氟攪拌子上，分別涂布1～4層多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物后，對(duì)AF B1、AF B2、AF G1、AF G2 萃取效率的影響，如圖1所示。結(jié)果顯示，當(dāng)攪拌棒的涂層為3層時(shí)，對(duì)4種黃曲霉毒素即可達(dá)到最大吸附能力。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇3層厚度的多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層攪拌棒對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行萃取。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 攪拌速率的優(yōu)化適度的攪拌可以加快固液界面的更新，減小溶液中待測(cè)組分的濃度梯度，增加待測(cè)組分向萃取基質(zhì)中的擴(kuò)散速率，從而縮短萃取時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察了不同的攪拌速率(100～500 r/min)對(duì)萃取效率的影響，如圖2所示。結(jié)果顯示，隨著攪拌速率的增大，目標(biāo)組分的萃取量逐漸增加，當(dāng)攪拌速率大于300 r/min時(shí)，萃取效率反而降低。因此，選擇最佳攪拌速度為300 r/min。

2.2.2 鹽效應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)在溶液中加入NaCl來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，考察其對(duì)萃取效率的影響。分別加入NaCl質(zhì)量濃度為0%、1%、2%、3%、4%，如圖3所示。結(jié)果顯示，隨著離子強(qiáng)度的增加，攪拌棒對(duì)4種黃曲霉毒素的萃取效率逐漸降低。因此，為獲得最佳萃取條件，本實(shí)驗(yàn)不加入NaCl。

圖2 攪拌速率對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of stirring rate on extraction efficiency

圖3 鹽濃度應(yīng)對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of salt concentration on extraction efficiency

2.2.3 萃取溫度的優(yōu)化萃取溫度對(duì)萃取效率具有重要影響。萃取溫度升高，目標(biāo)組分的傳質(zhì)速率加快，但同時(shí)目標(biāo)組分在萃取相內(nèi)的分配系數(shù)降低。本實(shí)驗(yàn)考察了萃取溫度為30、40、50、60、70 ℃對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，當(dāng)萃取溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，萃取效率達(dá)到最高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳萃取溫度為50 ℃。

2.2.4 萃取時(shí)間的優(yōu)化考察不同萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響，以色譜峰面積對(duì)萃取時(shí)間作圖，如圖5所示。結(jié)果顯示，從5 min到20 min，隨著萃取時(shí)間的增加，目標(biāo)組分的萃取效率逐漸增大，在20 min時(shí)達(dá)到峰值。隨后，繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間至40 min，其響應(yīng)值增加不超過(guò)2%。在充分權(quán)衡靈敏度和實(shí)驗(yàn)效率的情況下，本實(shí)驗(yàn)選擇20 min作為最佳萃取時(shí)間。

圖4 萃取溫度對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

圖5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.3 解吸條件的優(yōu)化

相對(duì)于靜態(tài)解吸，動(dòng)態(tài)解吸能夠加快溶液對(duì)流，提高溶液中待測(cè)組分的傳質(zhì)速度，加快解吸速率，從而縮短解吸時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)分別考察了超聲和攪拌兩種模式對(duì)待測(cè)組分解吸效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超聲20 min后，攪拌棒的涂層有損失，不利于攪拌棒的重復(fù)利用；而在攪拌模式下，涂層穩(wěn)定，因此采用攪拌模式對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行解吸。實(shí)驗(yàn)分別考察了不同攪拌速率(100、200、300、400、500 r/min)和不同解吸時(shí)間(0.5、1、2、3、4 min)的解吸效果，結(jié)果顯示攪拌速率為300 r/min、解吸時(shí)間為2 min時(shí)，解吸效果最佳，因此確定該條件作為解吸條件。

2.4 攪拌棒的耐用性考察

本實(shí)驗(yàn)考察了攪拌棒的耐用性進(jìn)。攪拌棒完成1次萃取后，依次用超純水和甲醇攪拌(300 r/min)各清洗1 min，重復(fù)清洗2次，取出攪拌棒，置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥，以備重復(fù)利用。在本實(shí)驗(yàn)中，取同一批不含黃曲霉毒的陳皮樣品，平行制備30份加標(biāo)樣品，經(jīng)70%的甲醇溶液超聲提取后，用于萃取，以黃曲霉毒的色譜峰面積作為測(cè)量參數(shù)，結(jié)果表明：前25份加標(biāo)樣品測(cè)定的各待測(cè)組分的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.1%，30份加標(biāo)樣品測(cè)定的各待測(cè)組分的峰面積的RSD為7.5%，說(shuō)明所制備的攪拌棒具有良好的耐用性。由于攪拌棒可以批量制備，數(shù)量充足，因此，在本實(shí)驗(yàn)中考慮到測(cè)量結(jié)果的重現(xiàn)性，攪拌棒重復(fù)使用20次后即不再繼續(xù)使用。

2.5 方法學(xué)研究與評(píng)價(jià)

精密吸取含AF B1、AF B2、AF G1和AF G2的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋成含4種目標(biāo)物的系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比(S/N)=3計(jì)，得到該方法的檢出限，相關(guān)數(shù)據(jù)均列入表1。取不被黃曲霉毒素污染的陳皮樣品，分別向其中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，測(cè)定加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 方法的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和檢出限

表2 加標(biāo)回收率和精密度(RSD,n=5)結(jié)果

圖6 混合對(duì)照品溶液(a)和陽(yáng)性陳皮樣品(b)色譜圖Fig.6 Chromatograms of standards(a) and Pericarpium Citri Reticulatae containing AF B1(b)1.AF G2;2.AF G1;3.AF B2;4.AF B1.

2.6 實(shí)際樣品分析

在各大型零售藥店和藥材市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)12批陳皮樣品，采用自制的攪拌棒對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行萃取，并進(jìn)行HPLC-FLD分析，色譜圖如圖6所示。測(cè)定結(jié)果表明：1份陳皮樣品檢測(cè)出AF B1，含量為0.8 μg/kg，未超過(guò)《中國(guó)藥典》規(guī)定的陳皮中AF B1的最大限量標(biāo)準(zhǔn)5 μg/kg[21]，其它陳皮樣品中未見(jiàn)上述4種黃曲霉毒素檢出，所有陳皮樣品檢測(cè)合格率為100%。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)制備多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物為涂層的攪拌棒對(duì)中藥材陳皮中的AF B1、AF B2、AF G1和AF G2進(jìn)行萃取，并結(jié)合HPLC-FLD對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)所制備的攪拌棒耐受性好，重復(fù)使用次數(shù)高。在優(yōu)化的條件下，對(duì)12批陳皮樣品進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均未超過(guò)《中國(guó)藥典》規(guī)定的最大限量標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，能夠滿足陳皮中黃曲霉毒素的測(cè)定要求，同時(shí)對(duì)其它中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中黃曲霉毒素的測(cè)定具有一定的借鑒意義。