何 丹， 陳 林， 周融融， 朱立華， 張水寒*,

(1.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南長(zhǎng)沙 410013；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117；4.湖南國(guó)華制藥有限公司，湖南長(zhǎng)沙410013)

復(fù)方菝葜顆粒(Compound Rhizome Smilacinus Granule，CRSG)是“湖南國(guó)華制藥有限公司”具有獨(dú)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤制劑，該制劑由菝葜、魚腥草、貓爪草、款冬花、土鱉蟲、枸杞子、大棗七味中藥材和鮮鱧魚組成，為臨床癌癥輔助治療的常用藥物?，F(xiàn)有研究表明，CRSG具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫等活性，適宜用于改善非小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌伴有咳嗽、胸痛、帶下異常等癥狀，該藥可供多種癌癥的輔助治療運(yùn)用[1 - 2]。

指紋圖譜以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究為導(dǎo)向，體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性、穩(wěn)定性三原則，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化，對(duì)于復(fù)雜體系的藥物質(zhì)量控制更全面。與高效液相色譜法(HPLC)相比，超高效液相色譜法(UPLC)在中藥材有效成分檢測(cè)和質(zhì)量控制方面，具有可以提供分離度更高，檢測(cè)更靈敏，大大縮減分離時(shí)間的優(yōu)勢(shì)[3 - 4]。無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別，如：系統(tǒng)聚類分析(HCA)及主成分分析(PCA)可綜合多指標(biāo)、多變量信息生成具有代表性的新指標(biāo)反應(yīng)樣本間的關(guān)系；而有監(jiān)督模式識(shí)別如：偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)等是更為高級(jí)的樣本分類方法，它們以主成分作為新變量進(jìn)一步確證樣本間差異的穩(wěn)定性及可靠性，同時(shí)尋找差異性代表。這種識(shí)別模式也廣泛應(yīng)用于中藥材及制劑的質(zhì)量控制中。

本研究采用超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)和化學(xué)模式識(shí)別方法，發(fā)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸和金絲桃苷可使不同批次間的復(fù)方菝葜顆粒樣本分為兩組，且這3個(gè)成分對(duì)復(fù)方菝葜顆粒發(fā)揮改善非小細(xì)胞肺癌和子宮頸癌等作用有貢獻(xiàn)[8 - 11]；有望進(jìn)一步研究作為復(fù)方菝葜顆粒質(zhì)量控制的活性成分群。本研究是對(duì)現(xiàn)有方法的有效補(bǔ)充，化學(xué)模式識(shí)別更加適合多類數(shù)據(jù)的分類分析，能為復(fù)方菝葜的質(zhì)量評(píng)估提供新的方法和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

1290 Infinity型高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技公司)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KM-500DB型超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(寧波雙嘉儀器有限公司)。

綠原酸對(duì)照品(純度≥99.39%，批號(hào)：MUST-17030620)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；落新婦苷對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：1DBG-QHTR)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;新綠原酸對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：CHB170914)、隱綠原酸對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：CHB170828)、金絲桃苷(純度≥98%，批號(hào)：CHB160904)、異槲皮苷(純度≥98%，批號(hào)：CHB160912)、3，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：CHB171013)、3，4-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：CHB160725)、4，5-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：CHB160726)均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸和甲醇均為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，其余試劑均為分析純，水(華潤(rùn)怡寶飲料(長(zhǎng)沙)有限公司)。

經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，菝葜為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖；魚腥草為二白草科植物蕺菜Houttuyniacordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分；貓爪草為毛莨科植物小毛莨RanunculusternatusThunb.的干燥塊根；枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarmL.的干燥成熟果實(shí)；大棗為鼠李科植物棗ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果實(shí)；款冬花為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾；土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉EupolyphagasinensisWalker或冀地鱉SteleophagaPlancyi(Boleny)的雌蟲干燥體。復(fù)方菝葜顆粒(湖南國(guó)華制藥有限公司，批號(hào)依次為S1：20170901、S2：20170902、S3：20171201、S4：20171202、S5：20180301、S6：20180302、S7：20180303、S8：20180401、S9：20180402、S10：20180403)。

1.2 色譜條件

色譜柱：EC-C18柱(50×3.0 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.3%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，2%A；2～5 min，2%～7%A；5～12min，7%～11%A；12～15min，11%～14%A；15～17 min，14%～16%A；17～18 min，16%～18%A；18～20 min，18%～20%A；20～21 min，20%～24%A；21～24 min，24%～26%A；24～28 min，26%～28%A；28～29min，28%A；29～30 min，28%～31%A；30～35 min，31%～48%A；35～38 min，48%A。體積流量：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異槲皮苷、金絲桃苷、落新婦苷、3，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩岣鲗?duì)照品適量，加適量甲醇制成含綠原酸90 μg/mL、新綠原酸102.7 μg/mL、隱綠原酸72.8 μg/mL、金絲桃苷101.8 μg/mL、落新婦苷133 μg/mL、異槲皮苷104.8 μg/mL、3，4-二咖啡酰奎寧酸217.8 μg/mL、3，5-二咖啡?？鼘幩?3.2 μg/mL，4，5-二咖啡?？鼘幩?5.5 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液精密稱取復(fù)方菝葜顆粒1.0 g，加甲醇定容至10 mL，稱重后密閉，于250 W、40 kHz超聲溶解，放冷后，加甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過(guò)濾，取濾液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到復(fù)方菝葜顆粒提取物，備用。

1.3.3 單味藥材供試品溶液精密稱取菝葜、魚腥草、貓爪草、枸杞子、大棗(去核)各15 g，款冬花、土鱉蟲各5 g，第一次加940 mL水(煎煮1.5 h)，第二次加752 mL水(煎煮1 h)，合并煎煮液，濃縮，利用冷凍干燥儀干燥，得浸膏,備用。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液(S1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜指紋圖譜，選擇出峰穩(wěn)定、峰面積較大、響應(yīng)值最高、分離度良好的8號(hào)峰(綠原酸)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于2%，表明儀器精密度良好。

1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)分別取CRSG(S1)6份，按照1.3.2方法制備供試品溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，以8號(hào)峰(綠原酸)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均低于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(S1)，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄指紋圖譜，以8號(hào)峰(綠原酸)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均低于2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 10批次復(fù)方菝葜顆粒UPLC指紋圖譜及其對(duì)照色譜圖Fig.1 UPLC fingerprints of ten batches of compound Rhizoma Smilacinus granul

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜的建立及共有峰指認(rèn)

2.1.1 指紋圖譜的建立按照1.3.2方法制備10批次樣品的供試品溶液，各取2 μL在1.2色譜條件下進(jìn)行色譜峰采集，得到10批CRSG的指紋圖譜，見(jiàn)圖1。確定18個(gè)色譜峰為10批CRSG所共有。使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A版)”軟件計(jì)算模擬得到對(duì)照色譜圖(R，見(jiàn)圖1)。以8號(hào)峰(綠原酸)為參照色譜峰(S)，計(jì)算10批CRSG各個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，不同批次間各共有峰的保留時(shí)間tR和相對(duì)峰面積的RSD大部分均在1%左右，初步判斷10批復(fù)方菝葜顆粒樣品成分較穩(wěn)定，但仍存在一定差異。

表1 10批復(fù)方菝葜顆粒指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

2.1.2 共有峰歸屬取1.3.1項(xiàng)下制備的除鮮鱧魚外的其余7味藥材樣品，分別精密吸取2 μL進(jìn)樣并記錄UPLC色譜圖，確認(rèn)復(fù)方菝葜顆粒UPLC指紋圖譜的18個(gè)特征峰的來(lái)源(圖2)。7種單味藥材對(duì)復(fù)方菝葜顆粒UPLC指紋圖譜均有貢獻(xiàn)，其中2、4、5、7、8、10、12～16號(hào)峰來(lái)自菝葜，2號(hào)峰來(lái)自魚腥草，1、3、9號(hào)峰來(lái)自貓爪草，5、7、9、13、14、17、18號(hào)峰來(lái)自款冬花，1和6號(hào)峰來(lái)自枸杞子，11號(hào)峰來(lái)自大棗。其中不同的單味藥材有多個(gè)共有峰，表明中藥材中其成分的復(fù)雜性。菝葜和款冬花擁有多個(gè)不同的共有峰，表明了這2味藥材對(duì)于整個(gè)復(fù)方的化學(xué)成分的重要性。

圖2 復(fù)方菝葜顆粒和各單味藥UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerpint of compound Rhizoma Smilacinus granul and single herb medicine

2.1.3 共有峰指認(rèn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 μL，進(jìn)樣并記錄色譜圖，對(duì)各色譜峰進(jìn)行成分指認(rèn)，見(jiàn)圖3。經(jīng)過(guò)相對(duì)保留時(shí)間和色譜峰行為比對(duì)，共確認(rèn)9個(gè)已知成分。分別為：5號(hào)峰(新綠原酸)、8號(hào)峰(綠原酸)、10號(hào)峰(隱綠原酸)、12號(hào)峰(落新婦苷)、13號(hào)峰(金絲桃苷)、14號(hào)峰(異槲皮苷)、15號(hào)峰(3,4-二咖啡?？鼘幩?、16號(hào)峰(3,5-二咖啡?？鼘幩?、18號(hào)峰(4,5-二咖啡?？鼘幩?。

圖3 復(fù)方菝葜顆粒指紋圖譜特征峰指認(rèn)Fig.3 Characteristic peak attribution in fingerprint of compound Rhizoma Smilacinus granul

2.2 相似度評(píng)價(jià)

采用相似度軟件計(jì)算樣品S1～S10的相似度，結(jié)果依次為：0.974、0.973、0.979、0.982、0.991、0.991、0.994、0.992、0.988、0.991。由此可知，10批次樣品中S5、S6、S7、S8、S9、S10相似度良好，均大于0.985；S1、S2、S3、S4相似度稍低，均大于0.970。來(lái)自不同批次CRSG樣品的UPLC色譜圖是相似的，各批次制劑共有成分出峰時(shí)間大致相同，成分較穩(wěn)定。

2.3 系統(tǒng)聚類分析(HCA)

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，對(duì)10批次復(fù)方菝葜顆粒進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。聚類結(jié)果顯示，10批次制劑大致可分為兩類：即2017年的各批次S1、S2、S3、S4聚為一類，2018年S5、S6、S7、S8、S9、S10聚為一類，其結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相互印證?？梢?jiàn)不同批次的復(fù)方菝葜顆粒各成分穩(wěn)定存在，在批次間各成分的含量還存在一定差異。

2.4 主成分分析(PCA)

將10批次復(fù)菝葜顆粒樣品的18個(gè)共有峰及其峰面積，創(chuàng)建10×18數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件，對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的PCA。獲得樣本PCA得分圖(圖5)，變量載荷圖(圖6)?？梢?jiàn)不同年份批次間有一定分開的趨勢(shì)，其中：S1～S4為一組，S5～S10為一組，與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果相仿，但中間仍有重疊部分。需要更高級(jí)的模式識(shí)別方法進(jìn)一步對(duì)樣品分類。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

圖5 10批樣品(S1～S10)的PCA得分圖Fig.5 PCA of score plot for10 samples(S1-S10)

2.5 正交偏最小二乘判別法分析(OPLS-DA)

圖6 18個(gè)變量的載荷圖Fig.6 Loading plot for 18 variables(S1-S12)

圖7 10批樣品(S1～S12)OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score plot of 10 samples

圖8 變量重要性投影圖Fig.8 VIP plot of OPLS-DA

3 結(jié)論

本研究采用UPLC法建立復(fù)方菝葜顆粒指紋圖譜，對(duì)各成分進(jìn)行藥材歸屬，并對(duì)主要特征峰進(jìn)行指認(rèn)，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)和HCA、PCA、OPLS-AD等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法考察批次間穩(wěn)定性，尋找造成批次間差異的特征性成分，希望為建立全面可靠的復(fù)方菝葜顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。