沈?qū)毩?，李云飛，韓擎天，高 生，陳 智，沈洪興，，殷 勇*

1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院骨科，上海 201800

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院骨科，上海 200001

急性脊髓損傷（SCI）多由嚴(yán)重交通事故、高速運動及高空墜落等引起，致殘率及致死率高，了解SCI 發(fā)生發(fā)展的機制有助于探尋避免SCI 后神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死的方法，保護(hù)脊髓神經(jīng)功能［1］。近年來，細(xì)胞自噬對SCI 的影響受到關(guān)注，p62 是一種常見的自噬蛋白［2］，其在急性SCI 后的表達(dá)變化及作用尚不清楚。本研究采用SD 大鼠建立高空重物垂直墜落打擊模型，觀察p62 在SCI 后不同時間點的表達(dá)變化，探尋p62 與急性SCI 是否存在關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF 級健康成年雌性SD 大鼠由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0003］，體質(zhì)量200 ～ 250 g，隨機分為假手術(shù)組和造模后1、3、7、14 d 組，每組6 只。根據(jù)實驗進(jìn)展及時補充動物模型。

1.2 動物模型的建立

動物實驗相關(guān)裝置和器械均由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。動物房恒溫，室溫控制在20℃。大鼠于術(shù)前禁食、水8 h。異氟烷吸入麻醉成功后，將大鼠俯臥位置于手術(shù)臺上，固定頭部及軀干，背部手術(shù)部位常規(guī)消毒。去除T7～9椎板，顯露T8脊髓背側(cè)，將預(yù)彎的不銹鋼片放置在脊髓表面，應(yīng)用高空重物垂直墜落擊打法（Allen 法），在離脊髓高約5 cm 處，用10 g 砝碼沿套管垂直落下，造成T8水平脊髓急性SCI 模型［3］。SCI 模型構(gòu)建成功評價標(biāo)準(zhǔn)：鼠尾出現(xiàn)痙攣，雙下肢痙攣抽搐后表現(xiàn)為完全癱瘓，打擊節(jié)段脊髓可見水腫、淤血等改變。造模成功后徹底沖洗消毒、清洗切口后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后給予頭孢拉定注射液0.25 g 肌內(nèi)注射，切口消毒，每日2 次輔助大鼠排尿排便，幫助改變體位，防止壓瘡發(fā)生，注意保暖。造模過程中3只大鼠死亡，立即予以補充。假手術(shù)組僅去除T7～9椎板后徹底沖洗消毒、清洗切口后逐層關(guān)閉切口。

1.3 觀察指標(biāo)

造模成功后，在術(shù)后1、3、7、14 d 采用國際通用Basso、Beattie、Bresnahan（BBB）評分標(biāo)準(zhǔn)［4］評價大鼠神經(jīng)功能。神經(jīng)功能評價完成后處死大鼠，每組隨機取3 只，獲取以受損脊髓為中心上下各1 cm 的包含椎體及附件的標(biāo)本組織，用4%多聚甲醛浸泡固定，48 h 后剝離出完整的脊髓組織，再次固定過夜，石蠟包埋、切片。取切片進(jìn)行常規(guī)HE 染色，觀察脊髓組織的病理學(xué)改變。

1.4 脊髓組織中p62的表達(dá)檢測

1.4.1 實時熒光定量PCR檢測

每組隨機取3 個受損脊髓組織，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR 反應(yīng)。p62 上游引物為5'-TCCCTGTCA AGCAGTATCC-3'，下游引物為5'-TCCTCCTTGGCTT TGTCTC-3'；GAPDH 上游引物為5'-AATGCATCCTG CACCACCAA-3'，下游引物為5'-GATGGCATGGACT GTGGTCA-3'。以GAPDH 為內(nèi)參計算p62 的相對表達(dá)量。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡檢測

每組隨機取3 個受損脊髓組織，充分裂解后取上清液，用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后在恒壓下進(jìn)行凝膠電泳。將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉后分別加入p62 抗體和β-actin 抗體（稀釋比例為1∶1 000，英國Abcam 公司）和HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶5 000，美國Santa-Cruz 公司）孵育，洗膜后觀察。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋的脊髓組織切片脫蠟；蒸餾水沖洗，PBS浸泡；3% H2O2室溫孵育，除去內(nèi)源性過氧化氫酶活性；5% BSA血清封閉，滴加適當(dāng)稀釋度的一抗和二抗工作液，37℃溫箱孵育；用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染。脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用表示，多組間比較采用單因素方差分析；以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評價

假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)功能BBB評分未見改變，仍為21.00 分。造模后1、3、7、14 d 組分別為（2.00±0.89）分、（4.67±1.03）分、（7.83±0.75）分、（14.50±1.05）分，與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 病理學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠脊髓組織神經(jīng)元和軸突結(jié)構(gòu)未見明顯異常（圖1a，b）；建模后1 d 組大鼠脊髓組織神經(jīng)元水腫，白質(zhì)髓鞘腫脹（圖1c，d）；建模后3 d 組大鼠脊髓組織神經(jīng)元進(jìn)一步水腫，白質(zhì)髓鞘持續(xù)腫脹（圖1e，f）；建模后7 d 組大鼠脊髓組織神經(jīng)元逐漸變性，部分壞死，白質(zhì)髓鞘水腫明顯（圖1g，h）；建模后14 d 組大鼠脊髓組織神經(jīng)元變性，周圍神經(jīng)元損傷范圍擴大，白質(zhì)髓鞘水腫變性（圖1i，j）。

2.3 p62 表達(dá)

圖 1 大鼠急性SCI后脊髓組織的病理學(xué)變化（×200）Fig.1 Pathological changes of spinal cord tissue after acute SCI in rats（×200）

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，造模后1、3 d 組大鼠脊髓組織中p62 水平增高但與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨后持續(xù)增高，造模后7、14 d 組大鼠脊髓組織中p62 水平與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，圖2）。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，p62 蛋白表達(dá)量從造模后1 d 開始持續(xù)增高至14 d（圖3）。免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)元中p62 表達(dá)主要以細(xì)胞核表達(dá)為主，在造模后1、3、7、14 d 組神經(jīng)元細(xì)胞核中p62 表達(dá)逐漸增加；膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)p62 也有表達(dá)，但隨著造模時間的延長增加不明顯（圖4）。

圖2 實時熒光定量PCR 檢測大鼠脊髓組織中p62 mRNA 的表達(dá)Fig.2 p62 mRNA expression of spinal cord tissue in rats detected by quantitative real-time PCR

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠脊髓組織中p62蛋白的表達(dá)Fig.3 p62 protein expression of spinal cord tissue in rats detected by Western blotting

3 討 論

細(xì)胞自噬是機體的一種防御機制，細(xì)胞通過自噬作用對變性蛋白及衰老細(xì)胞器進(jìn)行吞噬和降解，實現(xiàn)細(xì)胞的更新和再循環(huán)［5］。在正常情況下，適度的自噬可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是如果自噬過度則可能發(fā)生細(xì)胞自噬性死亡，反而對機體造成損傷［6］。近年來，對于SCI 后細(xì)胞自噬效應(yīng)的相關(guān)研究越來越多。Kanno 等［7］在小鼠的脊髓半切傷模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠SCI 后細(xì)胞自噬得到激活，自噬體數(shù)量增加明顯，在傷后4 h 即開始出現(xiàn)，3 d 時達(dá)到峰值，21 d 時仍有表達(dá)。Hou 等［8］在大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。Wang 等［9］在急性SCI 神經(jīng)元體外細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬體表達(dá)量在造模后0.5 h即開始增強，24 h達(dá)到峰值，72 h仍有較強表達(dá)。上述研究表明，細(xì)胞自噬在SCI 早期即被激活，自噬體強烈表達(dá)。

細(xì)胞自噬的活性可以通過透射電子顯微鏡下觀察自噬小體的形成量來確定，其可以作為檢測自噬水平的金標(biāo)準(zhǔn)［10］；此外，通過測定Beclin1、p62 蛋白量以及測定LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比值也可間接反映細(xì)胞自噬的活性［11］。p62 蛋白是一種常見的自噬蛋白，也稱SQSTM1 蛋白，其本質(zhì)是一種蛋白聚合體［2］。它的表達(dá)量增加可導(dǎo)致大腦神經(jīng)元細(xì)胞的減少和軸突退化，在帕金森綜合征及阿爾茲海默病中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量增加［12］。Tanabe 等［13］在小鼠脊髓擠壓動物模型和低氧神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)，用氯化鋰激發(fā)細(xì)胞自噬后導(dǎo)致p62 蛋白積聚增加，并出現(xiàn)低氧效應(yīng)下的神經(jīng)元細(xì)胞增生，而使用3-甲基嘌呤抑制自噬后則出現(xiàn)相反的結(jié)果。

圖4 免疫組織化學(xué)檢測大鼠脊髓組織中p62 蛋白的表達(dá)（×200）Fig.4 p62 protein expression of spinal cord tissue in rats detected by immunohistochemistry（×200）

由于臨床上很難獲得急性SCI 受損脊髓組織的病理模型，因此能較好模擬SCI 病理過程的動物模型顯得尤為重要。理想的動物模型應(yīng)能精準(zhǔn)反映SCI 的病理改變?nèi)^程，同時有可重復(fù)性和可控性。目前SCI 模型有很多，不同造模方式導(dǎo)致的損傷性質(zhì)也不盡相同［14］。鈍挫傷模型具有可操控性和可重復(fù)性的優(yōu)點，且約50%截癱患者的致傷原因為鈍挫傷，該模型適用于人類的SCI 研究［15］。Allen 重物墜落打擊模型及其改良模型造成的SCI 相對可控、可重復(fù)，是國際上較為認(rèn)可的急性SCI 模型［16］。

本研究采用改良Allen 法成功建立了急性SCI模型，造模后1、3、7、14 d 組BBB 神經(jīng)功能評分與假手術(shù)組相比均明顯降低，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)受損區(qū)域脊髓神經(jīng)元和白質(zhì)髓鞘發(fā)生腫脹并隨著損傷時間延長逐漸出現(xiàn)變性、壞死。實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，p62 蛋白表達(dá)量從造模后1 d 開始持續(xù)增高至14 d；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，p62 在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)以細(xì)胞核表達(dá)為主，并且從造模后1 d 即開始增加，一直持續(xù)增長至14 d，而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)相對較少，提示p62 對自噬作用的影響可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平而非轉(zhuǎn)錄后水平。

本研究存在一定局限性。改良Allen 法制作模型時，砝碼墜擊后無法及時移開，造成不同程度的脊髓壓迫傷，墜擊后反彈可能造成二次乃至多次打擊，與臨床急性SCI 受損機制不完全相符；且實驗周期較短，隨著時間推移，p62 在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)是否會繼續(xù)增高，還是趨于穩(wěn)定或者逐漸減少，有待進(jìn)一步觀察。