石峰， 唐青， 魏曉為

(1.阜寧縣人民醫(yī)院， 江蘇 鹽城 224000； 2南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 腫瘤 內(nèi)科， 江蘇 南京 210006)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。隨著我國生活水平提高及飲食結(jié)構(gòu)改變，CRC在國內(nèi)的發(fā)病率及死亡率逐漸上升，位居全部惡性腫瘤的第4位[1-3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)CRC患者可以及時的進(jìn)行手術(shù)治療，但其平均存活率仍然小于30個月[4]，因此，深入探索CRC的發(fā)病機(jī)制并尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(long-non coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個堿基的非編碼RNA，其在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中起著重要的作用[5-6]。近期研究顯示，LncRNA ASB16-AS1在惡性膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量顯著升高[7]，提示與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在潛在的關(guān)聯(lián)，但其在CRC中的作用尚未見報道。本研究首先檢測了LncRNA ASB16-AS1在CRC組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)，再采用特異性干擾片段下調(diào)了4株CRC細(xì)胞中ASB16-AS1的表達(dá)，比較4株CRC細(xì)胞的增殖情況及miR-185-5p表達(dá)；將含有ASB16-AS1野生型序列或突變序列的質(zhì)粒與miR-185-5p mimic或陰性對照 mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶法檢測轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，觀察lncRNA ASB16-AS1對miR-185-5的調(diào)控作用，探討ASB16-AS1與CRC發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1患者資料 選取2016年1月-2018年12月行手術(shù)治療的CRC患者26例，其中女10例、男16例，平均年齡(61.4±8.5)歲；所有患者在手術(shù)前均未經(jīng)過放化療，無家族性腸息肉病史、腸道慢性疾病史。在患者簽署知情同意書后于術(shù)中收集CRC組織及距離腫瘤邊緣5 cm以上的結(jié)直腸組織作為癌旁樣本，取材后迅速置于-80 ℃冷凍保存，術(shù)后病理檢查均診斷為腸腺癌。

1.1.2細(xì)胞株 人CRC細(xì)胞株(HT-29、SW-480、SW-620及LOVO)以及T293細(xì)胞均購自上海中喬新舟生物科技有限公司，細(xì)胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞置于37 ℃含有5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.1.3主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清均購自Gibco公司， lncRNA ASB16-AS1 干擾片段及陰性對照干擾片段購自上海吉瑪基因公司，Lipofectamine RNAiMAX、Opti及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；總RNA提取試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Green 逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR(qRT-PCR) Mix購自TOYOBO公司，CCK-8檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR 按照試劑盒說明書提取組織及細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以GAPHD作為ASB16-AS1的內(nèi)參照，以U6作為miR-185-5p的內(nèi)參照，采用2-(ΔΔCt)法計算ASB16-AS1及miR-185-5pmRNA的相對表達(dá)量。研究所用引物序列見表1。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ASB16-AS1的干擾靶點(diǎn)為5′- GGTTCTGAATCATTCAGTT-3′，將此序列打亂后，選擇不干擾其他基因表達(dá)的序列合成陰性對照干擾序列。將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長至80%時，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 qRT-PCR引物序列

轉(zhuǎn)染24 h后采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組(不轉(zhuǎn)染)及陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照干擾片段)。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測 采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞按照5 000個/孔的密度接種于96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)液100 μL。分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的0、24、48、7及96 h時，加入CCK-8試劑10 μL孵育細(xì)胞2 h，最后測量各組細(xì)胞450 nm處的吸光度值。

1.2.4雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 分別將含有ASB16-AS1野生型序列和其突變序列的質(zhì)粒與miR-185-5p mimic或者陰性對照 mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶檢測試劑檢測轉(zhuǎn)染24 h時的熒光強(qiáng)度。以熒光素酶的熒光強(qiáng)度為內(nèi)參，分析各組熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LncRNA ASB16-AS1 表達(dá)

如圖1A所示，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，ASB16-AS1在CRC組織中的表達(dá)水平顯著高于配對癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在4株CRC細(xì)胞(HT-29、SW-480、SW-620及LOVO)中，ASB16-AS1表達(dá)水平最高的為HT-29及LOVO細(xì)胞(圖1B)，因此選擇這2株細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：A為人CRC，B為CRC細(xì)胞；(1)與癌組織比較，P<0.01。

2.2 ASB16-AS1干擾效率

采用ASB16-AS1干擾片段分別轉(zhuǎn)染HT-29和LOVO細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染24 h時，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染ASB16-AS1干擾片段的HT-29和LOVO的細(xì)胞中ASB16-AS1表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，提示該干擾片段能夠顯著下調(diào)HT-29和LOVO細(xì)胞中ASB16-AS1的表達(dá)水平，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 干擾ASB16-AS1對CRC細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染ASB16-AS1干擾片段后，采用CCK-8法檢測對HT-29和LOVO細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖3所示，與陰性對照組比較，ASB16-AS1干擾48、72及96 h時，HT-29和LOVO細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示下調(diào)ASB16-AS1能夠顯著抑制CRC細(xì)胞株HT-29和LOVO的增殖。

注：A為HT-29細(xì)胞，B為LOVO細(xì)胞；(1)與陰性對照組比較，P<0.01。

注：A為HT-29細(xì)胞，B為LOVO細(xì)胞；(1)與同時點(diǎn)陰性對照組比較， P<0.01。

2.4 干擾ASB16-AS1對miR-185-p表達(dá)的影響

采用雙熒光素酶檢測ASB16-AS1與miR-185-p在293T細(xì)胞中的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果如圖4所示，含有野生型ASB16-AS1片段的載體和miR-185-5p mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其熒光素酶的活性顯著低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示ASB16-AS1上存在有miR-185-5p的特異性結(jié)合序列。本研究還在ASB16-AS1干擾片段轉(zhuǎn)染的HT-29及LOVO細(xì)胞中檢測了miR-185-5p的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，下調(diào)ASB16-AS1后HT-29及LOVO細(xì)胞中miR-185-5p的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示ASB16-AS1能夠調(diào)控miR-185-5p的表達(dá)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，人類大多數(shù)基因組被轉(zhuǎn)錄成非編碼核糖核酸[8-9]。LncRNA是指長度超過200個堿基的非編碼RNA，最近的研究表明lncRNA在各種病理生理過程中都發(fā)揮了重要作用[10]，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尤其受到關(guān)注，其中包括CRC[11-12]。CRC從正常上皮細(xì)胞發(fā)展為惡性腫瘤的過程涉及多種正常生長機(jī)制的破壞，包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡等[13]。異常的細(xì)胞增殖被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的典型特征，因此，抑制癌細(xì)胞的增殖成為抗腫瘤研究的關(guān)鍵，也是研究抗CRC的關(guān)鍵。lncRNA對CRC增殖的影響正逐漸受到重視，lncRNA MALAT1[14]、lncRNA RP4[15]、lncRNA SNHG1[16]、lncRNA CRNDE[17]、LncRNA-AK001058[18]等多個lncRNA均被證明在CRC的病理性增殖過程中發(fā)揮了重要作用。本研究也證明了lncRNA ASB16-AS1在CRC組織中表達(dá)升高，下調(diào)ASB16-AS1能夠抑制CRC細(xì)胞HT-29和LOVO的增殖及miR-185-5p的表達(dá)，并且ASB16-AS1上具有miR-185-5p的特異性結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，高表達(dá)的ASB16-AS1可能促進(jìn)了CRC細(xì)胞的增殖，ASB16-AS1可作為CRC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。張德龍等[7]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ASB16-AS1顯著促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。結(jié)合本研究結(jié)果，推測lncRNA ASB16-AS1可能是一個促腫瘤的lncRNA。

注：A為雙熒光素酶結(jié)果，B為2種ASB16-AS1與miR-185-5p結(jié)合關(guān)系；(1)與野生型ASB16-AS1+miR-185-5p mimic組比較，P<0.01。

注：A為HT-29細(xì)胞，B為LOVO細(xì)胞；(1)與陰性對照組比較，P<0.01。

LncRNA的作用機(jī)制十分復(fù)雜，他們可以與DNA、蛋白、mRNA或者miRNA結(jié)合，調(diào)控它們的表達(dá)[19-20]。更進(jìn)一步的研究表明lncRNA可以與miRNA的特異性位點(diǎn)結(jié)合、競爭性的調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因的表達(dá)[21-22]。本研究的結(jié)果也顯示ASB16-AS1上具有miR-185-5p的結(jié)合位點(diǎn)，下調(diào)ASB16-AS1后，2株CRC細(xì)胞中miR-185-5p的表達(dá)顯著升高。唐海林等[23]的研究也證實(shí)與癌旁組織相比，miR-185-5p在CRC組織中表達(dá)顯著降低，并且其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。此外，上調(diào)miR-185-5p能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖并且減少myc、cyclinD1等促腫瘤基因的表達(dá)[24]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示抑制ASB16-AS1能夠釋放miR-185-5p進(jìn)而抑制這些促腫瘤基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗CRC的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明lncRNA ASB16-AS1在CRC組織中表達(dá)升高，下調(diào)lncRNA ASB16-AS1可顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖。lncRNA ASB16-AS1上具有miR-185-5p的調(diào)控位點(diǎn)，抑制lncRNA ASB16-AS1能夠上調(diào)miR-185-5p的水平。lncRNA ASB16-AS1可能是治療CRC的潛在靶點(diǎn)。