鄭立肯 葉世蕓* 殷少文2 孫濟(jì)平 王 維

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴陽(yáng)市第三人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550006

痹者，閉也?！端貑枴け宰C》中記載：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”[1]，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有收錄運(yùn)用“醪酒”治療痹證[2]。中醫(yī)理論下由邪氣侵犯人體肌表經(jīng)絡(luò)引起的痛痹、行痹、著(濕)痹等合稱為“痹證”，以筋骨肌肉酸脹疼痛、麻痹、沉重甚至關(guān)節(jié)腫脹變形等為主要臨床表現(xiàn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中所認(rèn)為的慢性自身免疫性疾病，如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕多肌痛、風(fēng)濕熱、神經(jīng)痛等關(guān)節(jié)炎癥與疾病均屬于“痹證”范疇[3]。常規(guī)治療風(fēng)濕病癥的藥物有非甾體消炎止痛藥、糖皮質(zhì)激素、改善風(fēng)濕病情藥物(DMARDs)和α腫瘤壞死因子(TNF-α)抑制劑等新型生物制劑[4-5]，除單用常規(guī)合成藥外，亦采用csDMARD三聯(lián)療法(向甲氨蝶呤中加入羥氯喹和柳氮磺胺吡啶)、MTX-TNFi(甲氨蝶呤加入腫瘤壞死因子α抑制劑)聯(lián)合治療[6]，上述藥物除易產(chǎn)生藥物依賴性外亦可能引起心血管疾病、骨質(zhì)疏松以及高血壓等不良反應(yīng)[7-8]。中醫(yī)治療痹證常辨明風(fēng)寒濕熱，疾病新久，區(qū)分標(biāo)本虛實(shí)方進(jìn)行扶正、祛邪、通絡(luò)等治療[9]，以補(bǔ)虛藥、祛風(fēng)濕藥、解表藥、活血化瘀藥等相互配伍使用[10]，配合針灸、敷貼等外治法[11]或同生物制劑聯(lián)合使用，綜合治療達(dá)到良好的治療效果。

強(qiáng)筋祛濕液為貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫濟(jì)平教授的經(jīng)驗(yàn)方，該方中含有防己、川牛膝、尋骨風(fēng)等三十余味藥材，以祛風(fēng)除濕、活血化瘀為主要功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)腫脹，皮下?lián)p傷瘀血，皮膚擦傷潰破等。在前期研究基礎(chǔ)上，已初步建立強(qiáng)筋祛濕液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)從強(qiáng)筋祛濕液對(duì)抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛方面進(jìn)行主要藥效學(xué)與急性給藥毒性研究，以期為強(qiáng)筋祛濕液臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 試劑與藥品 二甲苯(批號(hào)：20140908，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司)；2,4-二硝基氯苯(批號(hào)：T20150905，西亞試劑)；完全弗氏佐劑(批號(hào)：F58810nl；USA)；強(qiáng)筋祛濕液(批號(hào)：20150501，貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；消腫止痛酊(批號(hào)：20150302，廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，雌性，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011；SD大鼠，SPF級(jí)，體重180～220g，雄性，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011；家兔，Ⅰ級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重2.1～2.5kg，雌雄各半，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001。

1.3 儀器 MNT50游標(biāo)卡尺(上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司)；AB204-S分析天平(上海)；YLS-3E電子壓痛儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；CT10R離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法[2]

2.1 強(qiáng)筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗(yàn) 取健康家兔18只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，即空白組、溶媒組、強(qiáng)筋祛濕液組，每組6只。以背脊為中線脫除背部脊柱兩側(cè)毛，約160 cm2(10 cm×16 cm)，溫水擦洗，24 h后檢查脫毛區(qū)域皮膚無損傷。各組受試家兔均按1.34 g·kg-1皮膚涂抹給藥，24 h后溫水洗去受試物，局部觀察家兔毒副反應(yīng)情況。如試驗(yàn)中出現(xiàn)死亡的家兔需進(jìn)行解剖，記錄組織的顏色和體積改變等。

2.2 對(duì)二甲苯致急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 健康小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液組(強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5、10、20倍計(jì)算)。空白組給予生理鹽水10 mL/kg、溶媒組給予同體積的溶劑，給藥組分別給予消腫止痛酊0.65 g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.86，0.93，0.47 g/kg涂于小鼠右耳廓0.2 mL，每次間隔12 h，連續(xù)給藥14 d，于末次給藥后30 min，每鼠右耳廓涂二甲苯0.1 mL；1 h后頸椎脫臼處死小鼠，打孔器取下左耳和右耳同一部位的圓片，稱重，計(jì)算耳廓腫脹度。公式如下：

腫脹度(mg)= 右耳片重-左耳片重

2.3 對(duì)角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 取SD大鼠60只，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，即空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液組(強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的3.5、7、14倍計(jì)算)，每組10只?？瞻捉M給予同體積生理鹽水，給藥組分別給予消腫止痛酊0.46 g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.30，0.65，0.33 g/kg涂于右后足跖，每次給藥間隔12 h，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后0.5 h分別于大鼠右后足跖皮內(nèi)注射1%角叉菜膠混懸液0.1 mL/只致炎；末次給藥前和給藥后2、3、4、5、6、8 h分別用游標(biāo)卡尺測(cè)右后足跖厚度，計(jì)算足跖腫脹率。

2.4 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型消炎作用 取SD大鼠70只，雄性，180～220 g，按體重隨機(jī)分為7組：空白組、模型組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組，游標(biāo)卡尺測(cè)定右后足跖厚度?？瞻捉M右后足跖皮內(nèi)注射生理鹽水10 mL/kg，其余6組右后足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.1 mL致炎。次日，空白組和模型組于生理鹽水涂抹于足跖，溶媒組涂抹同體積的高粱酒，其余4組分別給消腫止痛酊0.46 g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.3，0.65，0.33 g/kg，藥液涂于右側(cè)足跖。每天間隔12 h，連續(xù)給藥13 d。

觀察指標(biāo)：測(cè)量致炎第1 天、第7 天和第13 天右后足跖腫脹度和壓痛值。給藥第14 天，取股動(dòng)脈取血5 mL，3000 r/min離心15 min，離心后取血清-20 ℃冷藏，采用IL-6和TNF-α定量酶聯(lián)檢測(cè)放射免疫試劑盒檢測(cè)血清中白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF -α)炎癥因子；取關(guān)節(jié)滑膜HE染色病理檢測(cè)。

2.5 對(duì)小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響 每次取1只18～22 g雌性小鼠放在已預(yù)熱10 min(55±0.5 ℃)的熱板上，自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間(秒)作該鼠的痛閾值。選擇痛閾值范圍為5～30 s的小鼠。將合格小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只分為：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組(強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5倍、10倍、20倍計(jì)算)，分別給生理鹽水10 mL/kg、高粱酒10 mL/kg、消腫止痛酊0.65 g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.86、0.93、0.47 g/kg藥液涂于雙后足跖，每次給藥間隔12 h，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后2 h 用熱板法測(cè)痛閾值，計(jì)算痛閾變化率；在測(cè)試中如60 s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 強(qiáng)筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗(yàn) 由表1、2可知，給藥后觀察14 d，期間動(dòng)物未出現(xiàn)中毒及死亡，用溫水洗去皮膚上的受試物，未觀察到皮膚紅斑、水腫等反應(yīng)。給藥期間動(dòng)物體重均有增長(zhǎng)，給藥組、溶媒組與空白組統(tǒng)計(jì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3.2 對(duì)二甲苯至急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 致炎后，各組小鼠右耳高度紅腫。與空白組比較，消腫止痛酊組與強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥后腫脹度顯著低于空白組，而溶媒組無明顯差異。表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 家兔急性毒性試驗(yàn)觀察結(jié)果 (1～14d)

組別0 d7 d14 d空白組2.31±0.092.35±0.102.39±0.10溶劑組2.29±0.112.33±0.122.37±0.14強(qiáng)筋祛濕液組2.24±0.122.31±0.112.36±0.10

組別腫脹度/ mg腫脹率腫脹抑制率/%空白組6.6±2.110.69±0.24-溶劑組5.77±2.100.65±0.2812.58消腫止痛酊組2.07±1.20*0.24±0.15*68.64低劑量組2.60±1.39*0.27±0.15*68.18中劑量組1.98±1.21*0.23±0.15*70.00高劑量組2.10±1.06*0.22±0.11*60.61

注：與空白組比較,*P<0.05。

3.3 對(duì)角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 由表4可知，同空白組比較，注射角叉菜膠后測(cè)量所有組別大鼠足趾腫脹率減弱，同時(shí)消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液各劑量組大鼠足趾腫與空白組比較有明顯差異。表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)角叉菜膠致大鼠的足趾腫脹具有抑制作用。

3.4 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型消炎作用 由表5可知，在連續(xù)給藥7 d至13 d后，消腫止痛酊組與強(qiáng)筋祛濕液藥酒的高、中、低劑量組在致炎后大鼠的足趾腫脹度減弱，與模型組比較有明顯差異。繼續(xù)給藥至第13 天后，陽(yáng)性對(duì)照藥物消腫止痛酊與強(qiáng)筋祛濕液的低、中、高劑量組在致炎后大鼠的足趾壓痛值提高，并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而溶媒組仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明強(qiáng)筋祛濕液可有效減輕炎癥同時(shí)消腫止痛。由圖1可知，造模14 d佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中TNF -α、IL-6的濃度顯著性增加，消腫止痛酊組和強(qiáng)筋祛濕液組可顯著性降低TNF -α、IL-6的濃度。

致炎后不同時(shí)間足跖腫脹率組別2 h3 h4 h5 h6 h8 h空白組0.60±0.120.51±0.110.39±0.100.40±0.110.39±0.100.35±0.08溶媒組0.51±0.080.48±0.070.37±0.060.36±0.120.42±0.100.32±0.10消腫止痛酊0.48±0.070.38±0.08*0.27±0.06*0.26±0.08*0.25±0.09*0.20±0.11*低劑量0.46±0.110.44±0.150.32±0.080.30±0.06*0.26±0.08*0.25±0.11中劑量0.43±0.160.37±0.160.22±0.09*0.22±0.09*0.14±0.09*0.12±0.09*高劑量0.50±0.110.26±0.08*0.18±0.07*0.15±0.07*0.12±0.08*0.13±0.04*

注：與空白組比較，*P<0.05。

組別 1d 7d 13d 腫脹率壓痛值腫脹率壓痛值腫脹率壓痛值空白組0.01±0.06601.93±190.920.00±0.05956.58±235.090.02±0.04791.81±344.47模型組0.63±0.10247.72±55.910.64±0.07288.17±32.840.57±0.19285.70±169.52溶媒組0.56±0.09245.63±48.360.55±0.12635.5±192.930.43±0.16443.61±113.96消腫止痛酊組0.60±0.08339.69±214.940.52±0.10#917.11±352.42#0.37±0.08#550.88±178.94##低劑量組0.64±0.12261.00±68.87#0.52±0.12#700.57±255.11#0.40±0.06#614.54±254.00##中劑量組0.70±0.10273.55±90.84#0.50±0.13#720.81±434.74#0.30±0.09##671.24±308.16##高劑量組0.56±0.11273.25±53.06#0.40±0.09#847.61±576.90##0.29±0.11##634.63±260.23##

注：與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

由圖2可知，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取右后肢關(guān)節(jié)滑膜固定于10%的甲醛溶液中，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，切片并HE染色后，空白組滑膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈單層排列，滑膜細(xì)胞無水腫；模型組滑膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重增生，滑膜細(xì)胞水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；消腫止痛酊組滑膜上皮細(xì)胞輕微增生，滑膜細(xì)胞水腫不明顯；強(qiáng)筋祛濕液組滑膜上皮細(xì)胞少量增生，滑膜下見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞輕度水腫。表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)佐劑致大鼠關(guān)節(jié)炎病變有明顯改善作用。

3.5 對(duì)小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響 由圖3可知，在不同時(shí)間內(nèi)的痛域值有顯著性差異，各個(gè)藥物組之間的痛域值差異有顯著性意義。與空白對(duì)照組相比較，消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組的痛域值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在第14 天時(shí)，痛域值具有顯著性差異，表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。

4 討論

強(qiáng)筋祛濕液由防己、川牛膝、杜仲、紅花等35味中藥制備而成，主藥防己稱為“祛風(fēng)濕要藥”，有效成分粉防己堿用于治療水腫、風(fēng)濕性疾病和炎性疾病[13]，研究表明粉防己堿可通過抑制NF-κB/ COX-2通路有效降低RA大鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6的濃度[14-15]，通過依賴芳烴受體(AhR)相互調(diào)節(jié)STAT3和STAT5活性[16]以恢復(fù)Th17/ Treg平衡發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎功效[17]。川牛膝甾酮類化合物、杜仲提取物等亦可減少促炎細(xì)胞因子與環(huán)氧合酶-2的分泌，改善軟骨代謝保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[18-20]。因此，實(shí)驗(yàn)以足跖腫脹度、TNF -α、IL-6以及痛閾值為指標(biāo)，對(duì)強(qiáng)筋祛濕液鎮(zhèn)痛抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其臨床用藥的有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)顯示，家兔給予強(qiáng)筋祛濕液后未出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫等反應(yīng)，提示強(qiáng)筋祛濕液安全性良好；從抗炎、鎮(zhèn)痛以及對(duì)大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型等方面評(píng)價(jià)了強(qiáng)筋祛濕液的藥理作用，結(jié)果表明其可有效抑制炎癥并增加受試動(dòng)物痛閾值。強(qiáng)筋祛濕液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹、對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹具有不同程度的抑制作用，給藥后3 h高劑量組大鼠足趾腫脹率減弱，同空白組比較出現(xiàn)明顯差異，表明強(qiáng)筋祛濕液具有抗炎作用。給藥組在不同時(shí)間內(nèi)痛域值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。同時(shí)，強(qiáng)筋祛濕液可顯著性降低佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α的濃度與水平，提示強(qiáng)筋祛濕液抗類風(fēng)濕的機(jī)理或與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子有關(guān)。各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜經(jīng)HE染色后結(jié)果表明強(qiáng)筋祛濕液對(duì)佐劑致大鼠關(guān)節(jié)炎病變有明顯改善作用。

綜上所述，強(qiáng)筋祛濕液對(duì)完全佐劑、對(duì)角叉菜膠所導(dǎo)致足趾腫脹度與二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有極顯著的抑制作用，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示安全性較好，且對(duì)皮膚無明顯皮膚過敏反應(yīng)，可顯著下調(diào)佐劑關(guān)節(jié)炎模型血清中炎性細(xì)胞因子水平，顯著提高痛閾值。故強(qiáng)筋祛濕液對(duì)于痹證有良好的作用效果，作為院內(nèi)制劑具有良好的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。