李群 范娟 魏榮榮 葉正琴 丁國(guó)偉

摘 ?要：豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）14 d后就可以產(chǎn)生針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-Structural Protein 7，Nsp7）的抗體，而且抗體水平很高，與N蛋白抗體水平相似，但比N蛋白抗體持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。另外，檢測(cè)Nsp7抗體可用于區(qū)分PRRSV I型和II型的感染。本試驗(yàn)旨在建立一種快速、特異且敏感的檢測(cè)血清中PRRSV抗體的方法。試驗(yàn)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)錄入的Nsp7蛋白序列（GenBank：EF536003）設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增Nsp7基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Nsp7，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。利用親和層析純化重組蛋白，Western Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。將純化后的重組蛋白按不同濃度包被酶標(biāo)板，通過(guò)方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度及血清稀釋度，并對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化，最終建立檢測(cè)PRRSV Nsp7抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法。結(jié)果表明，試驗(yàn)表達(dá)了重組Nsp7蛋白，重組的Nsp7蛋白能與PRRSV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，建立了一種基于重組Nsp7蛋白的間接ELISA檢測(cè)方法。建立的間接ELISA檢測(cè)方法分別與商品化PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比，兩者符合率為87.74%。試驗(yàn)表明，建立的間接ELISA方法可以用于PRRSV抗體的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;Nsp7基因;原核表達(dá);間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2019）08-0012-07

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為患病母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)和產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔等繁殖障礙以及仔豬嚴(yán)重的呼吸道疾病，具有較高的死亡率[1]。由于病死豬呈特征性的耳朵發(fā)紺現(xiàn)象，該病又被稱(chēng)為豬藍(lán)耳病。該病目前存在于我國(guó)的大部分省市，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年夏季，我國(guó)南方部分省市大規(guī)模暴發(fā)以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“豬高熱病”，后確診為高致病性豬藍(lán)耳病，其病原為PRRSV的變異株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV），與經(jīng)典的PRRS病毒株相比，以非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-Structural Protein 2，Nsp2）中有一個(gè)特征性30個(gè)氨基酸缺失為特征，具有更強(qiáng)的致病性。后來(lái)有研究證明，毒株的毒力增強(qiáng)與Nsp2特征性缺失30個(gè)氨基酸無(wú)關(guān)，目前對(duì)其毒力增強(qiáng)的原因尚不清楚[2-3]。病毒變異可能是引起PRRS大規(guī)模暴發(fā)的原因，也給該病的防治帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。建立快速可靠的PRRSV抗體檢測(cè)方法，監(jiān)測(cè)PRRS流行病學(xué)以及檢測(cè)豬群接種PRRS疫苗后的抗體水平對(duì)該病的預(yù)防具有重要意義。

PRRSV屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的且不分節(jié)段的正鏈單股RNA病毒。PRRSV基因組長(zhǎng)為15.1 kb～15.5 kb，含有9個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），分別編碼PP1a、PP1ab，GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白，其中PP1a經(jīng)病毒蛋白酶消化分解產(chǎn)生9個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1α、Nsp1β、Nsp2～Nsp8），PP1ab經(jīng)消化分解為4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp9～Nsp12）[4]。在上述結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白、GP5蛋白和Nsp7蛋白是檢測(cè)抗體的重要靶點(diǎn)[5]。其中，針對(duì)Nsp7蛋白的抗體產(chǎn)生較早，豬感染PRRSV 14 d后就可以產(chǎn)生針對(duì)Nsp7的抗體，而且抗體水平很高，幾乎可以達(dá)到N蛋白和Nsp2的抗體水平，而且比N蛋白抗體持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，這表明Nsp7與機(jī)體免疫應(yīng)答關(guān)系密切。Nsp7基因在非結(jié)構(gòu)蛋白基因中相對(duì)保守，雖然北美型和歐洲型Nsp7氨基酸序列同源性?xún)H有45%，但各型之間的同源性卻很高，歐洲型的同源性在96.7%～97.4%，美洲型的同源性為84.9%～100%，這一特點(diǎn)使得Nsp7蛋白成為檢測(cè)抗原、檢測(cè)PRRSV抗體水平及區(qū)分不同毒株抗體的首選抗原[6-7]。

本研究擬從PRRSV經(jīng)典株VR2332株基因組中擴(kuò)增出編碼Nsp7蛋白基因片段，重組至表達(dá)載體pET-28a（+）中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定，以表達(dá)的Nsp7蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，為PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體

E. coli TOP10、E. coli BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞和pET-28a載體，均購(gòu)于Invitrogen公司。pMD19-T載體購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.2 病毒和血清

JAX1株和豬PRRSV陽(yáng)性血清由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司提供。

1.1.3 主要試劑

FastPfu DNA聚合酶、dNTPs、BamH I、Xho I、Trans2K plus DNA marker和Blue plus Protein marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司。Trizol@ Reagent試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司。HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。HRP標(biāo)記的鼠抗豬IgG酶標(biāo)二抗和IPTG均購(gòu)自Sigma公司。其他試劑為分析純級(jí)試劑，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。IDEXX PRRS X3試劑盒購(gòu)自愛(ài)德士。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的PRRSV VR2332序列（登入號(hào)：EF536003），利用oligo7.27設(shè)計(jì)引物，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé)。

Nsp7-up：CGCGGATCCTCTCTGACTGGTGCCC TCGC。

Nsp7-down：CCGCTCGAGTTATTCCCATTGAACTCTTCCATTC。

1.2.2 PRRSV總RNA提取

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

1.2.3 PRRSV Nsp7基因片段擴(kuò)增

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板，Nsp7-up和Nsp7-down為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：1 ?L模板、1 ?L Nsp7-up、1 ?L Nsp7-down、10 ?L緩沖液、4 ?L dNTPs、1 ?L Fastpfu和32 ?L ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s和72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定片段大小。大小合適的PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行膠回收。

1.2.4 PRRSV Nsp7基因片段的克隆與鑒定

將經(jīng)膠回收的目的片段連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組pMD19-Nsp7。將經(jīng)菌落PCR鑒定正確的單克隆送金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.5 原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD19-Nsp7用 BamH I和Xho I雙酶切處理。酶切產(chǎn)物電泳，膠回收目的片段，與進(jìn)行同樣操作的pET-28a進(jìn)行連接，得到的重組質(zhì)粒命名為28a-Nsp7。將重組質(zhì)粒28a-Nsp7轉(zhuǎn)入E. coli BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑去陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，鑒定正確的重組菌命名為BL21/28a-Nsp7。

1.2.6 BL21/28a-Nsp7的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組菌BL21/28a-Nsp7單菌落接種到LB培養(yǎng)基（含卡那霉素終濃度100 μg/mL）中，37 ℃、220 r/min，培養(yǎng)至光密度（Oplicald Dnsity，OD）600 nm=0.8左右，加入終濃度為 ? 0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)夜，誘導(dǎo)溫度為20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)轉(zhuǎn)速為150 r/min。

1.2.7 重組蛋白的純化與鑒定

誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體，將收集到的菌體用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗滌2次，并用PBS緩沖液重懸菌體。在冰浴條件下超聲波裂解菌體，裂解結(jié)束后分別對(duì)裂解上清和沉淀取樣，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）。使用鎳柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化步驟為：細(xì)胞破碎上清在結(jié)合緩沖液中過(guò)夜透析，透析液上樣過(guò)柱（5 mL HisTrap，GE HealthCare），再用結(jié)合緩沖液洗滌5個(gè)柱體積，最后用洗脫緩沖液洗滌5個(gè)柱體積，收集洗脫組分，并用SDS-PAGE蛋白電泳鑒定。

1.2.8 Western Blot鑒定

蛋白樣品跑完SDS-PAGE后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)方式進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜緩沖液為：三羥甲基氨基甲烷（Tris）3.0 g，甘氨酸（Gly）14.4 g，甲醇200 mL，加去離子水至1 000 mL。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂乳封閉，4 ℃過(guò)夜，封閉結(jié)束后用PBST洗三遍，加PRRSV陽(yáng)性血清孵育2 h，孵育結(jié)束后用PBST洗5遍，加辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的鼠抗豬IgG孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBST洗5遍，最后加沉淀型四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min～30 min，拍照。

1.2.9 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

● 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

按照方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將純化抗原做6個(gè)包被梯度，分別稀釋至終濃度為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL和0.312 5 μg/mL，4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板。PRRSV陰性和陽(yáng)性血清按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600倍稀釋后進(jìn)行方陣試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)，取其平均值，計(jì)算每個(gè)條件下陽(yáng)性血清OD450 nm（P）/陰性血清OD450 nm（N）。選擇陽(yáng)性血清OD450 nm值接近1.0，P/N值最大的反應(yīng)組合作為間接ELISA的最佳反應(yīng)條件。

● 血清最佳作用時(shí)間的選擇

加入一抗后，分別在37 ℃作用30 min、60 min和90 min后進(jìn)行間接ELISA測(cè)定。

● 二抗稀釋濃度的選擇

以最適抗原包被濃度、封閉液以及最佳PRRSV陰性和陽(yáng)性血清稀釋度分步加入反應(yīng)后，鼠抗豬IgG-HRP分別做1∶5 000、1∶10 000、 ? ?1∶20 000、1∶30 000和1∶40 000稀釋?zhuān)缓蟀闯Ｒ?guī)間接ELISA程序測(cè)定。

● 二抗作用時(shí)間的選擇

按最佳條件進(jìn)行包被、封閉和加樣，加入二抗后37 ℃下分別孵育30 min、60 min、 ? ? ?90 min和120 min，通過(guò)間接ELISA測(cè)定陽(yáng)性血清的OD450 nm值和陰性血清的OD450 nm值，比較P/N值以選擇最適二抗作用時(shí)間。

● 顯色時(shí)間的確定

按照已篩選條件進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，最后加入TMB分別顯色5 min、10 min和15 min，測(cè)定其陽(yáng)性血清的OD450 nm值和陰性血清的OD450 nm值。

● ELISA臨界值的確定

用建立的間接ELISA方法檢測(cè)43份PRRSV抗體陰性血清，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。計(jì)算平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，以O(shè)D450 nm

1.2.10 間接ELISA試劑盒特異性試驗(yàn)

用建立的間接ELISA方法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型（Porcine CircoVirus Type 2，PCV2）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhoea Virus，PEDV）、豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)置PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。

1.2.11 比對(duì)試驗(yàn)

取臨床血清767份（來(lái)源于全國(guó)養(yǎng)殖戶(hù)送檢血清），用建立的間接ELISA方法和進(jìn)口的PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)測(cè)定血清樣品，可疑樣品重復(fù)檢測(cè)一次，若仍為可疑，即判為陽(yáng)性。比較檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算二者符合率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 PRRSV Nsp7基因擴(kuò)增

運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增PRRSV的Nsp7非結(jié)構(gòu)蛋白基因，擴(kuò)增得到了一條大小約為777 bp的目的片段（圖1），與理論片段大小一致。

2.2 pMD19-Nsp7的PCR和酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pMD19-Nsp7進(jìn)行PCR鑒定，可以擴(kuò)增出大約777 bp大小的特異性片段，經(jīng)雙酶切鑒定，可以得到與理論大小一致的片段（圖2）。

2.3 PRRSV Nsp7蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

用菌落PCR初步鑒定陽(yáng)性克隆，再利用雙酶切對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3。

2.4 Nsp7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

重組菌在20 ℃、0.4 mmol/L IPTG以及150 r/min條件下過(guò)夜誘導(dǎo)，離心收集菌體，超聲波裂解菌體，對(duì)全菌和破碎上清進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，由圖4可以看出，目的蛋白獲得了較好的可溶性表達(dá)。重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，用SDS-PAGE蛋白電泳鑒定純化后的表達(dá)產(chǎn)物，在30 kDa處得到一條單一條帶，與理論大小相符，表明該條帶為PRRSV Nsp7蛋白（圖4）。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后轉(zhuǎn)至NC膜，進(jìn)行Western Blot鑒定，如圖5所示。

2.5 重組PRRSV Nsp7蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立

2.5.1 最佳抗原包被濃度及最佳血清稀釋度的確定

由方陣滴定結(jié)果可知（表1），當(dāng)重組抗原包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時(shí)，陽(yáng)性血清OD450 nm讀值接近1.0，且P/N值最大。因此，確定最佳抗原包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。

2.5.2 血清最佳作用時(shí)間的確定

表2結(jié)果顯示，當(dāng)血清作用30 min時(shí)，P/N值最大。因此，血清最佳作用時(shí)間為30 min。

2.5.3 最佳二抗稀釋度和二抗作用時(shí)間的確定

按照2.5.1和2.5.2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行間接ELISA操作，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4，二抗以1∶10 000稀釋?zhuān)?7 ℃作用60 min時(shí)OD450 nm最為適宜，P/N值最大，因此二抗的最佳作用濃度為1∶10 000，最佳作用時(shí)間是60 min。

2.5.4 最適底物作用時(shí)間的確定

抗原、血清和酶標(biāo)抗體按照以上最適工作條件進(jìn)行，加入底物后，于37 ℃分別作用 ? ?5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，終止反應(yīng)，測(cè)定OD450 nm值。測(cè)定結(jié)果（表5）顯示，在37 ℃下作用10 min可以作為顯色時(shí)間的最佳條件。

2.5.5 臨界值的確定

選取43份陰性血清，按照上述建立的間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)得的OD450 nm進(jìn)行處理，平均值為0.353，標(biāo)準(zhǔn)差為0.022，x+2s=0.397，x+3s=0.419。因此，OD450 nm< 0.397判為陰性，OD450 nm≥0.419判為陽(yáng)性，0.397≤OD450 nm<0.419為可疑。

2.5.6 與IDEXX試劑盒比較試驗(yàn)結(jié)果

選取IDEXX試劑盒檢測(cè)過(guò)的血清樣品，總計(jì)767份，使用上述試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)這些樣品進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果與IDEXX產(chǎn)品對(duì)比顯示，IDEXX試劑盒檢測(cè)樣品的陽(yáng)性率為92.4%，陰性率為7.5%;上述試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)樣品的陽(yáng)性率為94.7%，陰性為5.2%;兩者符合率為87.74%。

2.5.7 特異交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

利用重組Nsp7蛋白建立的間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)PCV2、PRV、CSFV、FMDV、TGEV和PEDV陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性，PRRSV陰陽(yáng)性血清對(duì)照均成立（表6）。結(jié)果說(shuō)明建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有較高的特異性。

3 ?討論

用于PRRSV檢測(cè)的ELISA試劑盒包被用抗原主要有純化的PRRSV全病毒和重組N蛋白兩種[8]。由于全病毒抗原純化工藝復(fù)雜，有些細(xì)胞培養(yǎng)成分不易純化干凈，容易引起較強(qiáng)的非特異性反應(yīng)或背景反應(yīng)，而且會(huì)有潛在的散毒危險(xiǎn)，故當(dāng)前很少使用[9]。ORF7編碼的N蛋白是PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是PRRSV病毒粒子中含量最多的病毒蛋白。PRRSV感染豬體后，首先誘導(dǎo)產(chǎn)生抗N蛋白的抗體。1977年Denal等首先報(bào)道了用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得重組N蛋白，建立了重組N蛋白間接ELISA方法[10]。Dea S等用大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法[11]。近年有研究人員利用GP5-AB蛋白、重組Nsp7蛋白和重組Nsp2蛋白建立檢測(cè)PRRSV的ELISA方法，敏感性和特異性也較高[12]。

本研究使用重組Nsp7蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，這是由于在PRRSV感染中，Nsp7抗體產(chǎn)生較早，豬體感染PRRSV 14 d后就可以產(chǎn)生針對(duì)Nsp7的抗體，免疫原性較高，抗體水平幾乎可以達(dá)到N蛋白和Nsp2的抗體水平，而且比N蛋白持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

本研究的重組Nsp7蛋白以可溶形式存在，具有正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，可以增加檢測(cè)的特異性和敏感性。再通過(guò)優(yōu)化各種檢測(cè)條件，建立了特異性、重復(fù)性和靈敏度較好的間接ELISA方法，從而進(jìn)行PRRSV的阻斷及疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。通過(guò)與IDEXX生產(chǎn)的PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)767份臨床血清樣本對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究建立的ELISA方法檢測(cè)結(jié)果與商品化試劑盒符合率為87.74%。造成這一現(xiàn)象的原因可能是兩種試劑盒所用包被抗原不同，商品化試劑盒采用重組N蛋白作為抗原，而本研究采用重組Nsp7蛋白作為抗原。PRRSV N蛋白有一定的變異性，本研究選取具有保守性的基因（Nsp7）進(jìn)行原核表達(dá)，以此建立間接ELISA檢測(cè)方法，可增加對(duì)變異株產(chǎn)生抗體的檢出率，增加檢測(cè)方法的敏感性和特異性，減少假陰性的出現(xiàn)。

綜合上述結(jié)論，本研究建立的基于PRRSV Nsp7蛋白的間接ELISA方法，具有良好的重復(fù)性和特異性，并可能在臨床上成為檢測(cè)豬群中PRRSV抗體水平及檢測(cè)PRRS流行情況的有效方法?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（12篇，略）