李夢雯， 呂亞莉， 徐國彤， 呂立夏

(1. 同濟大學醫(yī)學院再生醫(yī)學系生物化學與分子生物學教研室，上海 200092; 2. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)，也稱老年性黃斑變性，是全世界老年人失明的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細胞的氧化損傷和慢性炎癥被認為是AMD的發(fā)展過程中重要的影響因素[2-3]。應激分子伴侶也稱為HSPA13，是熱休克蛋白家族的一員，由鈣離子誘導[4]。活性氧類(reactive oxygen species, ROS)導致細胞內(nèi)鈣離子超載，引發(fā)細胞凋亡[5-6]。

細胞內(nèi)鈣離子水平升高誘導HSPA13基因的表達上升，因此，本研究探討HSPA13在氧化應激誘導的人視網(wǎng)膜上皮ARPE19細胞中的表達情況，以及HSPA13的表達水平對氧化應激誘導的ARPE19細胞中相關(guān)氧化應激指標和促炎因子的影響；并在干擾HSPA13表達后進行RNA測序，對差異表達的基因進行基因本體(gene ontology, GO)分析及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信號通路分析，為進一步探索HSPA13在AMD中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

DME/F12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；鏈霉素及青霉素、CCK8試劑盒、丙二醛(malondialdehyd，MDA)試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自碧云天公司；3%H2O2購自美國Sigma公司；anti-HSPA13、anti-β-actin、二抗購自Proteintech公司；TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA試劑盒購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 使用DME/F12基礎培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清和500μL的青霉素鏈霉素雙抗，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人ARPE19細胞。

1.2.2 CCK8法測定細胞活力的改變 實驗前使用細胞培養(yǎng)基配制H2O2處理液，以2×104/mL的密度將ARPE19細胞接種在96孔板中，細胞貼壁后，分別添加含終濃度為10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2的細胞培養(yǎng)基處理細胞，處理4h。將體積分數(shù)為10%的CCK8工作液加入H2O2空白對照組(不含H2O2的細胞培養(yǎng)組)、各濃度H2O2處理組和只含培養(yǎng)基的無細胞對照組中，將細胞培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱30min。隨后在450nm波長處檢測各孔的光密度值(D450)。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR 待200μmol/L H2O2處理4h，TRIzol裂解液收集總RNA，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測HSPA13和抗氧化酶[超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1, GPX1)、過氧化氫酶(catalase, CAT)]的表達。各待測物引物序列如下。HSPA13 SOD1上游引物: 5′-TGTGGCCG-ATGTGTCTAT-TG-3′；下游引物: 5′-GCGTTTCC-TGTCTTTGTACTTTC-3′。GPX1上游引物: 5′-GACTACACCCAGATGAACGAG-3′；下游引物: 5′-GGACGT-ACTTGAGGGAATTCAG-3′。CAT上游引物: 5′-CAGATAGCCTTCGACCCAAG-3′；下游引物: 5′-GTAGGGACAGTTCACAGGTATATG-3′。β-actin上游引物: 5′-GAATCCCCGCCTAAGCTGA-3′；下游引物: 5′-AAGTTCGCGCTGGATAGGGCT-AC-3′。數(shù)據(jù)分析: 3次同樣處理，測得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western印跡法檢測HSPA13蛋白含量 200μmol/L H2O2處理4h，使用RIPA裂解液裂解細胞沉淀后，進行BCA定量和蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到0.45μm的PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，HSPA13一抗4℃孵育過夜，相應種屬的二抗室溫孵育1h，ECL顯影采集蛋白條帶圖。實驗重復3次，使用Image J軟件進行條帶分析，以β-actin作為內(nèi)參，對條帶的灰度值進行半定量分析。

1.2.5 免疫熒光檢測HSPA13的表達 待200μmol/L H2O2處理4h，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1%TritonX-100透膜和3%BSA封閉步驟之后，HSPA13一抗4℃冰箱過夜，二抗室溫孵育1h，DAPI染核封片，使用Nikon激光共聚焦顯微鏡，拍照分析HSPA13蛋白的表達。

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)LipofectamineTM3000說明書將HSPA13過表達質(zhì)粒(pEGFP-N2-HSPA13)或siRNA(siHSPA13)轉(zhuǎn)染到ARPE19細胞中。pEGFP-N2空載體作對照。pEGFP-N2-HSPA13上游引物: 5′-GTGATGCCCAGAGAGATGACGATC-3′；下游引物: 5′-TCAGTTGAAGTTGGTTTTTTGT-AAATG-3′。靶向GATCCCCGGCTGACGTCTTCC-ACGTC的HSPA13的小干擾RNA(siHSPA13)由拓然生物公司合成。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，采用經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的200μmol/L H2O2處理4h，進行相關(guān)的檢測。

1.2.7 MDA和GSH含量測定及ROS檢測 根據(jù)試劑盒說明書，采用比色法檢測ARPE19細胞內(nèi)MDA、GSH的含量；采用DCF法測定ROS，用激光共聚焦顯微鏡Nikon A1R檢測細胞內(nèi)的熒光強度。

1.2.8 ELISA檢測促炎因子的分泌 使用200μmol/L H2O2處理過表達或干擾HSPA13的ARPE19細胞4h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，分別根據(jù)TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA試劑盒說明書進行測定。

1.2.9 差異表達基因的基因本體與通路分析 將RNA測序得到的有效數(shù)據(jù)中空載組與HSPA13干擾組進行比較，對差異倍數(shù)≥1.5并且P<0.05的基因使用數(shù)據(jù)庫(DAVID)進行GO富集分析和KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2處理對ARPE19細胞活力的影響

為探討合適的H2O2處理濃度，使用不同的濃度處理細胞4h，進行細胞活力檢測。CCK8法檢測結(jié)果顯示，隨著H2O2處理濃度的上升，細胞活力降低。H2O2空白對照組及10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2處理組的細胞活力分別為1.002±0.008991、0.9563±0.0427、0.9666±0.02949、0.8157±0.04948、0.7787±0.03957、0.6405±0.05403、0.4475±0.06583和0.2822±0.03536。100、200、300、400μmol/L的H2O2處理組與H2O2空白對照組相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 氧化應激誘導ARPE19細胞中HSPA13的表達上調(diào)

為模擬氧化損傷的自然條件，本研究后續(xù)均采用差異有統(tǒng)計學意義的200μmol/L的H2O2處理ARPE19細胞4h建立氧化損傷模型。收集H2O2空白對照組和200μmol/L H2O2處理組的ARPE19細胞，檢測HSPA13的表達變化。Western印跡法結(jié)果表明，與H2O2空白對照組相比，200μmol/L H2O2處理組HSPA13蛋白的表達上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0097，P=0.0152)。另外，采用免疫熒光方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察HSPA13的表達與定位情況，結(jié)果見圖1。

圖1 HSPA13在氧化應激誘導的ARPE19細胞中表達上升Fig.1 The expression of HSPA13 was increased in oxidative stress-induced ARPE19 cells A: HSPA13蛋白的表達水平；B: 細胞免疫熒光(標尺: 50μm)；實驗重復3次

2.3 CCK8法檢測HSPA13的表達水平對過氧化氫誘導的細胞活力的影響

ARPE19細胞受到氧化刺激后，HSPA13的表達上調(diào)。為了明確HSPA13的表達水平對氧化應激狀態(tài)下細胞活力的影響，分別過表達或干擾HSPA13，200μmol/L H2O2處理后，CCK8法檢測細胞活力。CCK8法結(jié)果顯示，H2O2空白對照組、200μmol/L H2O2處理組、過表達HSPA13加200μmol/L H2O2處理組和siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組的細胞活力分別為1.145±0.0472、0.593±0.0319、0.808±0.0428、0.394±0.0492。因此，這一結(jié)果提示HSPA13的表達水平可能在ARPE19的氧化應激中發(fā)揮保護作用。

2.4 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)SOD1、GPX1和CAT mRNA的影響

空載體200μmol/L H2O2處理組(Vector+H2O2)的ARPE19細胞中SOD1、GPX1和CAT的mRNA的表達均顯著降低，與空載體對照組(Vector)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，過表達HSPA13加200μmol/L H2O2處理組(HSPA13+H2O2)中SOD1和GPX1的mRNA表達上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2A～D。相反地，與單獨200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組中SOD1、GPX1和CAT的mRNA表達均降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2E～H。

圖2 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)SOD1、GPX1和CAT mRNA的影響Fig.2 Effect of the expression level of HSPA13 on SOD1, GPX1 and CAT mRNA in ARPE19 cells A～D： HSPA13過表達；E～F： HSPA13被干擾；實驗重復3次；*P<0.05；**P<0.01

2.5 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)MDA、GSH含量的影響

200μmol/L H2O2處理4h后，MDA的含量顯著上升(P<0.05)，GSH含量顯著下降(P<0.05)；與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，HSPA13過表達加200μmol/L H2O2處理4h后，MDA含量降低(P<0.05)，GSH含量上升(P<0.05)；相反地，與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組的MDA含量上升，GSH含量下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)MDA和GSH含量的影響Fig.3 Effect of the expression level of HSPA13 on MDA and GSH content in ARPE19 cells 實驗重復3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.6 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)促炎因子分泌的影響

細胞遭受氧化損傷后可引發(fā)一系列炎癥反應，其中包括促炎因子的分泌。200μmol/L H2O2處理過表達或干擾HSPA13的ARPE19細胞4h后，收集細胞培養(yǎng)基上清液檢測TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量。與空載體對照組相比，空載體200μmol/L H2O2處理組中TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，過表達HSPA13加200μmol/L H2O2處理組中IL-8、IL-2和IL-1β的含量下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4A～D。相反地，與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組中TNFα、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4E～H。

圖4 HSPA13的表達水平對ARPE19細胞內(nèi)促炎因子分泌的影響Fig.4 Effect of the expression level of HSPA13 on the secretion of related-proinflammatory cytokines in ARPE19 cellsA～D： HSPA13過表達；E～F： HSPA13被干擾；實驗重復3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.7 干擾HSPA13的表達增加氧化應激誘導的ARPE19細胞中ROS的水平

ROS常被用作判定細胞水平氧化損傷程度的指標[7]。與H2O2空白對照組相比，200μmol/L H2O2處理組的DCF熒光信號明顯增強；與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組DCF熒光信號顯著增強，見圖5。結(jié)果表明，ARPE19細胞內(nèi)HSPA13的水平影響氧化應激狀態(tài)下細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

2.8 基因芯片檢測兩組之間差異表達的基因

提取空載組和HSPA13干擾組的總RNA進行RNA測序分析，共檢測到18660個基因。其中包括HSPA13基因的表達差異，差異倍數(shù)約為1.33。為了獲得精準的基因GO富集分析和KEGG信號通路分析結(jié)果，只將RNA測序結(jié)果中差異倍數(shù)≥1.5且差異表達(P<0.05)的基因使用DAVID進行分析，因此HSPA13沒有被篩選進入后續(xù)分析步驟。根據(jù)設定的前提條件進行篩選后發(fā)現(xiàn)，差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05的差異表達的基因有318個，其中表達上調(diào)的有64個，下調(diào)的有254個，對這些差異表達的基因進行GO富集和KEGG分析。

2.9 差異基因的GO功能分析

通過GO分析，可以將差異表達的基因根據(jù)功能分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3類。表達上調(diào)的基因分為細胞外空間、細胞因子活性和光刺激的感覺知覺類，表達下調(diào)的基因分為骨骼系統(tǒng)發(fā)展、細胞外基質(zhì)、細胞黏附和腫瘤壞死因子細胞應答類，見圖6。

圖5 干擾HSPA13的表達增加氧化應激誘導的ARPE19細胞中ROS的水平(標尺: 50μm)Fig.5 Knockdown of HSPA13 expression increased oxidative stress-induced levels of ROS in ARPE19 cells(scale： 50μm)

圖6 差異基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.10 差異基因的KEGG信號通路分析

對差異基因進行KEGG分析，結(jié)果表明共有8條信號通路與下調(diào)基因相關(guān)(均P<0.05)，見表1。下調(diào)基因的KEGG信號通路分析結(jié)果顯示多條信號通路發(fā)生下調(diào)，如ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、黏著斑(focal adhesion)、TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)和細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)。

表1 下調(diào)基因的KEGG相關(guān)信號通路分析

3 討 論

AMD是發(fā)達國家老年人視力喪失的主要原因，但這種復雜疾病的發(fā)病機制尚不明確[8]。目前研究證據(jù)表明氧化應激和慢性炎癥在年齡相關(guān)的RPE細胞損傷中發(fā)揮重要作用[9-10]。RPE細胞遭受長期氧化刺激導致DNA損傷，細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細胞功能被破壞[11]。細胞遭受氧化損傷可引起細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導致細胞鈣超載[12-13]。

HSPA13作為熱休克蛋白70家族中重要的一員被克隆并明確定位于人類染色體21q11.1[14]。該基因編碼一個相對分子質(zhì)量為60000的蛋白，亞細胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其編碼的蛋白N端含有特殊前導疏水序列，這種特殊的結(jié)構(gòu)導致它與其他熱休克蛋白不同的是HSPA13受鈣離子誘導，對熱刺激無反應[15]。在鱗狀頭頸癌中，在腫瘤細胞中高表達的蛋白BAK1、HSPA13和CCND1表達降低在很大程度上可以抑制腫瘤的發(fā)生[16]。此外，HSPA13還與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默癥、癲癇等有關(guān)[17-18]。日本科學家發(fā)現(xiàn)HSPA13在體外過表達通過調(diào)節(jié)細胞死亡通路來增強細胞的存活率[19]。目前，HSPA13在AMD中的作用尚未有相關(guān)報道。因此，根據(jù)HSPA13的特殊性，本研究推測HSPA13可能參與了鈣離子介導的RPE細胞的氧化應激過程。HSPA13是細胞內(nèi)鈣離子依賴性蛋白，RPE細胞氧化應激狀態(tài)下，細胞鈣超載，可上調(diào)HSPA13的表達。

本研究結(jié)果表明，200μmol/L H2O2處理4h引起ARPE19細胞中HSPA13的表達上升。發(fā)現(xiàn)在ARPE19細胞中過表達HSPA13能夠減弱H2O2誘導的促炎因子的釋放并上調(diào)抗氧化酶的表達，提高GSH的細胞內(nèi)含量，保護細胞活力，提示HSPA13可能在AMD的發(fā)生發(fā)展中有一定的作用。與預期一致，HSPA13被干擾后轉(zhuǎn)染ARPE19細胞，ROS產(chǎn)生增加，加劇了RPE細胞的氧化損傷。

為了更全面了解HSPA13在ARPE19氧化應激中的作用機制，本研究收集空載體組和HSPA13被干擾組的ARPE19細胞進行RNA測序分析，結(jié)果顯示有318個基因有顯著的表達差異。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，與空載組相比，HSPA13被干擾組有8條信號通路參與其中。其中包括PI3K-Akt通路、細胞因子相關(guān)受體通路、TGFβ信號通路、ECM受體相互作用等。PI3K-Akt信號通路參與多種細胞生存與代謝過程[20-21]。有研究表明，PI3K-Akt通路在氧化應激中發(fā)揮重要作用，在AMD體外氧化應激模型中，Akt磷酸化的增強可以保護RPE細胞免受氧化損傷觸發(fā)的細胞凋亡和壞死[22]。

KEGG分析表明，HSPA13干擾組中ECM受體相互作用下調(diào)。ECM參與細胞的分裂、增殖、代謝以及凋亡等多種細胞生命活動，為細胞存活和代謝的正常進行提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境[23]。之前研究證實，ECM的異常與AMD的形成有關(guān)[24-25]。GO分析發(fā)現(xiàn)，ECM相關(guān)信號通路的基因LAMA4、COL4A1、BMPER、TENM2、COL1A1、MAMDC2、ITGB3、ZNF469和THBS1的表達均降低，這提示HSPA13影響RPE細胞的ECM，參與氧化應激過程中ECM的調(diào)節(jié)。另外，KEGG分析還可以發(fā)現(xiàn)，HSPA13干擾組中細胞因子-細胞因子受體相互作用通路下調(diào)，該通路在AMD模型的炎癥反應研究中發(fā)揮重要作用[26]。因此，對于RNA測序信號通路結(jié)果的進一步驗證是后續(xù)的研究方向。

綜上所述，外源性H2O2可以誘導ARPE19細胞中鈣應激蛋白HSPA13的表達上升，過表達HSPA13能夠減少促炎因子的釋放，提高抗氧化酶的表達和細胞內(nèi)GSH水平，提示HSPA13對ARPE19細胞氧化應激的保護作用。本研究從分子水平解析AMD的發(fā)病機制，為尋找AMD新的治療靶點提供有益的線索。