成穎瑩， 王 娟， 戎偉芳， 張國花

(上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與生理學(xué)系，上海 200025)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，1型糖尿病患者胃腸道并發(fā)癥比較常見，如胃輕癱、腸道動力異常等[1]。由腸嗜鉻細(xì)胞合成并分泌的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)參與調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動、腸神經(jīng)發(fā)生、上皮細(xì)胞的分泌及血管的舒張，同時參與黏膜的生長維持與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[2]。有研究表明5-HT參與糖尿病血糖和胰島素分泌的調(diào)節(jié)[3]，5-HT4受體激動劑可以改善糖尿病小鼠胃輕癱[4]。本研究旨在研究結(jié)腸及血液中5-HT在1型糖尿病發(fā)展過程中的變化特點(diǎn)及外源性給予5-HT對糖尿病大鼠血糖和結(jié)腸運(yùn)輸功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD雄性大鼠46只，體質(zhì)量200～220g,2月齡，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，自由進(jìn)食飲水，恒溫25℃。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要藥品與試劑 鏈脲佐菌素(streptozo-tocin， STZ)、5-HT、洋紅(carmine)購自Sigma公司；羊抗5-HT抗體購自Neuromics公司；Alexa fluro 568標(biāo)記的驢抗羊二抗購自Invitrogen公司；BCA蛋白測定試劑盒、增強(qiáng)型顯影液購自Thermo Scientific公司；預(yù)染蛋白marker、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自Bio-rad公司；兔抗色氨酸羥化酶(TPH1)抗體購自Millipore公司；鼠抗β-actin購自Bioworld公司。

1.2.2 主要儀器 羅康全活力型血糖儀購自德國羅氏診斷有限公司；冰凍切片機(jī)、熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司；Ultimate 3000 UHPLC高效液相色譜系統(tǒng)購自Dionex公司；冷凍離心機(jī)、TSQ Vantage三重四級桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)購自Thermo Scientific公司；顯影儀ImageQuant LAS 4000購自GE公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠1型糖尿病模型的建立 采用腹腔注射STZ建立大鼠1型糖尿病模型。將STZ溶解于0.01mol/L冰冷的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.0)，腹腔注射給藥(50mg/kg)，對照組腹腔注射等體積的緩沖溶液。3d后檢測血糖濃度，選取血糖濃度≥15mmol/L的大鼠(模型建立成功)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。模型建立過程中，持續(xù)觀測動物的體質(zhì)量和血糖情況。

1.3.2 免疫熒光組織化學(xué) 為了研究1型糖尿病進(jìn)程中結(jié)腸5-HT表達(dá)變化特點(diǎn)，利用免疫熒光方法檢測5-HT免疫陽性細(xì)胞的數(shù)目變化。用冰凍切片機(jī)將固定并包埋好的結(jié)腸組織塊切片，15μm厚，貼片于載玻片上。用含10%正常驢血清的1% PBST在室溫下封閉1h；一抗為羊抗5-HT(1∶1000)室溫孵育4h后4℃孵育過夜，陰性對照的一抗用1% PBST代替。用Alexa fluro 568標(biāo)記的驢抗羊(1∶1000)和DAPI(1∶1000)常溫下孵育1h。0.05mol/L PBS清洗后用封片劑封片。使用熒光顯微鏡拍照，每只動物隨機(jī)選取4～6個視野，并計(jì)數(shù)免疫陽性表達(dá)細(xì)胞。

1.3.3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)檢測大鼠血清中5-HT含量 大鼠麻醉后用膠帶仰臥位固定在木板上，打開胸腔暴露心臟，用1mL注射器吸取左心室動脈血500～1000μL，轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管中，4℃靜置過夜。第2天，常溫下5000×g，離心10min后取上清液，用HPLC-MS檢測血清中5-HT的含量，測得的5-HT濃度單位為ng/mL。

1.3.4 Western印跡法 為了進(jìn)一步明確在糖尿病發(fā)展進(jìn)程中，外周5-HT含量的減少是否與其合成速率下降有關(guān)，采用Western印跡法檢測結(jié)腸黏膜組織中5-HT合成的限速酶TPH1的蛋白表達(dá)水平。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)溶液麻醉大鼠，暴露腹腔，剪取1cm左右的結(jié)腸，用眼科剪小心地沿腸系膜中線將所取腸段剪開，黏膜層朝上鋪平在載玻片上，在組織的一側(cè)用刀片劃出切口，隨后用細(xì)胞刮板從切口處開始均勻用力，將結(jié)腸上層的全部黏膜層組織刮下來。組織經(jīng)裂解液裂解蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取30μg蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗為兔抗TPH1抗體孵育4℃過夜，使用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗常溫下孵育2h，在成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光并記錄。

1.3.5 外源性5-HT的給藥方案 根據(jù)5-HT在1型糖尿病進(jìn)程中的變化特點(diǎn)，在糖尿病模型建立兩周后，腹腔注射5-HT(10mg/kg,溶解于0.9% NaCl)，隔天1次，共6次[5]，對照組注射同體積溶劑，第6次注射后1d進(jìn)行大鼠結(jié)腸動力行為學(xué)測定。

1.3.6 大鼠結(jié)腸動力行為學(xué)測定 在結(jié)腸動力行為學(xué)測定前1周內(nèi)對各組大鼠進(jìn)行結(jié)腸置管手術(shù)[6]。主要將聚乙烯PE10導(dǎo)管距盲腸2cm處置于結(jié)腸內(nèi)2.5cm，導(dǎo)管另一端沿皮下穿出固定于頸部皮膚。大鼠結(jié)腸置管術(shù)后約5d進(jìn)行結(jié)腸動力學(xué)行為檢測。實(shí)驗(yàn)時向?qū)Ч苤凶⑷胄迈r配置的洋紅-纖維素溶液(6%,0.5mL)，隨后持續(xù)觀察10h，記錄帶有紅色染料糞便的排出時間，計(jì)算非糖尿病組均值，并將所有數(shù)值與均值進(jìn)行對比，比較各組之間的相對變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病模型大鼠結(jié)腸及血清內(nèi)5-HT的含量減少

免疫組化方法檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸組織中5-HT的表達(dá)隨著糖尿病的進(jìn)程呈進(jìn)行性下降，具有時間依賴性： 5-HT免疫陽性反應(yīng)的細(xì)胞主要分布在黏膜層，可能主要是上皮腸嗜鉻細(xì)胞和固有層中肥大細(xì)胞[7]。與非糖尿病組相比，糖尿病模型建立后1、2和4周，黏膜層上皮和固有層中5-HT陽性表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量均出現(xiàn)顯著性減少(P=0.0003,P=0.002,P<0.0001)，見圖1A、圖1B。利用HPLC-MS方法檢測發(fā)現(xiàn)與非糖尿病組相比，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠血清中的5-HT濃度在模型建立后3～4周時出現(xiàn)明顯降低(P=0.002,P=0.0009)，見圖1C。

圖1 STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠外周5-HT含量下降Fig.1 The decrease of peripheral 5-HT level in SYZ-induced type 1 diabetic rats.A、B： 結(jié)腸5-HT免疫熒光染色的變化；與ND組比較，D組1～4周時，大鼠結(jié)腸組織中5-HT免疫陽性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(**P<0.01,***P<0.001)；C： 各組大鼠血清中5-HT濃度的變化；與ND組相比，D組3、4周時，血清中5-HT含量明顯降低(**P<0.01,***P<0.001)；ND： 非糖尿病;D： 糖尿病

2.2 糖尿病模型大鼠結(jié)腸組織內(nèi)TPH1的蛋白水平無變化

Western印跡法結(jié)果顯示： 與非糖尿病組大鼠相比，糖尿病組4周時大鼠結(jié)腸黏膜組織中TPH1的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著的變化，見圖2。

圖2 STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠結(jié)腸黏膜層 組織內(nèi)TPH1蛋白水平的變化Fig.2 The change in TPH1 protein level in mucosa of colon in STZ-induced type 1 diabetic rats D組與ND 4周組大鼠結(jié)腸黏膜層組織內(nèi)TPH1的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.6913)；ND： 非糖尿病; D： 糖尿病

2.3 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠血糖和體質(zhì)量的影響

進(jìn)一步觀察了外源性補(bǔ)充5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量和血糖的影響。結(jié)果顯示： 與非糖尿組大鼠相比，糖尿病對照組大鼠出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量下降(圖3B)和血糖升高(圖3C)；外源性給予5-HT后，與糖尿病對照組相比，糖尿病5-HT處理組(D-5-HT)體質(zhì)量(圖3B)和血糖(圖3C)均沒有較大的變化。

圖3 外源性5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量和血糖的影響Fig.3 The effects of exogenous 5-HT on body weight and blood glucose of diabetic ratsA： 給予動物外源性5-HT方案；B、C： 外源性5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量與血糖的影響[糖尿病對照動物體質(zhì)量下降和血糖升高(**P<0.01,***P<0.001)；外源性給予5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量下降沒有影響；外源性5-HT給藥后1周可輕微減輕了糖尿病大鼠血糖的升高，但是依然高于15mmol/L；給藥后2周5-HT對糖尿病大鼠血糖升高無影響]；ND： 非糖尿病;D： 糖尿病

2.4 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙的影響

進(jìn)一步觀察了外源性補(bǔ)充5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸功能的影響。結(jié)果如圖4所示： 與非糖尿病組大鼠相比，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病組大鼠排出帶紅色染料糞便的時間明顯延長,即變化百分比增大[非糖尿病組為(100.0±36.9)%,糖尿病組為(354.4±58.7)%，P=0.032]，說明1型糖尿病模型大鼠的結(jié)腸動力功能出現(xiàn)了一定的障礙；外源性給予5-HT能明顯縮短糖尿病大鼠結(jié)腸運(yùn)輸時間，即變化百分比下降[糖尿病組為(354.4±58.7)%,糖尿病5-HT組為(101.4±34.9)%，P=0.050]。

圖4 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸動力功能的影響Fig.4 The effect of exogenous 5-HT on the colonic motility of diabetic rats與ND組相比，##P<0.01；與DC組相比，**P<0.01；ND： 非糖尿病;DC： 糖尿病對照

3 討 論

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂。2013年流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)約有3.8億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2030年會達(dá)到6億[8]。糖尿病患者血糖的升高，往往累及多種器官并引起并發(fā)癥，其中，胃腸道并發(fā)癥最為常見[9]，比如胃輕癱、便秘等，也有研究表明糖尿病患者結(jié)直腸癌患病風(fēng)險增高[10]；這些均嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，而臨床治療仍存在諸多限制。

外周5-HT主要由腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cell, EC)分泌，參與機(jī)體生理與病理狀態(tài)下的多種反應(yīng)。5-HT在糖尿病模型動物體內(nèi)的含量變化是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)： 在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠中，十二指腸EC的數(shù)量與5-HT的含量均顯著增高[11]；四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型成模6周后，從胃到結(jié)腸等不同部位5-HT含量急劇下降[5]；在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠全血5-HT含量下降，而腸道5-HT含量明顯上升[12]。上述研究表明5-HT變化與模型建立方法、檢測時間結(jié)點(diǎn)和檢測部位有關(guān)。本研究通過對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進(jìn)行結(jié)腸5-HT免疫陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)及心臟動脈血血清5-HT含量的連續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)糖尿病模型建立后1周，結(jié)腸黏膜層中5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)目即開始減少，且隨著糖尿病的進(jìn)程呈進(jìn)行性減少，具有時間依賴性；而且血清5-HT的含量也在模型建立后3周顯著降低，可見在STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠進(jìn)程中，結(jié)腸和外周的5-HT水平總體處于一個缺乏的狀態(tài)。由于5-HT的合成是通過TPH1對色氨酸進(jìn)行羥基化而引發(fā)的，而TPH1是5-HT合成的限速酶；因此，5-HT的產(chǎn)生受TPH1的活性和色氨酸的可用性調(diào)節(jié)[3]。所以本研究檢測了糖尿病進(jìn)程中結(jié)腸5-HT合成的主要限速酶TPH1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病動物結(jié)腸黏膜層組織中TPH1的表達(dá)沒有明顯變化，提示在糖尿病發(fā)展過程中，5-HT的合成速率沒有發(fā)生改變。近年來，腸道菌群紊亂與1型糖尿病之間的相關(guān)性受到學(xué)者關(guān)注[13-15]，而腸道菌群影響5-HT的合成和分泌[16]，今后會進(jìn)一步研究腸道菌群紊亂與1型糖尿病與外周5-HT水平下降之間的關(guān)系。

有研究提示5-HT參與糖代謝和胰島素分泌的調(diào)控： 在正常個體中，5-HT可以降低正常小鼠的血糖，改變其血清胰島素水平；但是在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠中，5-HT既不改變血糖水平，也不改變其血清內(nèi)胰島素的水平[17]；然而，在2型糖尿病患者中，5-HT可刺激胰島素釋放[18]。本實(shí)驗(yàn)證明了外源性給予糖尿病大鼠5-HT后，1型糖尿病大鼠的體質(zhì)量和血糖并沒有明顯的改變。這進(jìn)一步說明，5-HT對1型糖尿病大、小鼠的血糖升高均沒有抑制作用。綜上，5-HT可能對糖尿病個體糖代謝及胰島素分泌的調(diào)控與糖尿病的類型有關(guān)。

糖尿病腸道動力障礙的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣： 平滑肌細(xì)胞功能損傷[19]、Cajar間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常[20-21]、自主神經(jīng)病變[22-23]、胃腸神經(jīng)元病變[24-25]、胃腸激素分泌異常[26-27]、巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)改變[28]等均可以引起糖尿病的胃腸動力障礙。5-HT以旁分泌的形式，參與調(diào)控胃腸蠕動和分泌，對胃腸動力具有促進(jìn)作用，若EC細(xì)胞或5-HT信號通路發(fā)生異常，可能會導(dǎo)致胃腸動力出現(xiàn)相應(yīng)的異常變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，糖尿病動物存在結(jié)腸動力障礙，而且結(jié)腸和外周血清中5-HT水平呈進(jìn)行性下降，而外源性給予5-HT能改善糖尿病動物的結(jié)腸動力障礙，增加動物排出糞便的速度。這進(jìn)一步說明，5-HT的減少，與糖尿病結(jié)腸動力障礙存在一定的相關(guān)性。外源性補(bǔ)充5-HT可能通過多方面的作用改善結(jié)腸動力障礙： (1) 5-HT可能通過5-HT4型受體直接作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和運(yùn)動神經(jīng)元，引起乙酰膽堿、P物質(zhì)和CGRP協(xié)同釋放促進(jìn)平滑肌收縮[29]；(2) 5-HT可能通過5-HT4型受體減輕神經(jīng)損傷死亡[30-31]進(jìn)而抑制糖尿病自主神經(jīng)和/或胃腸神經(jīng)病變改善動力障礙。這一推測尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，外周5-HT水平隨1型糖尿病進(jìn)程呈進(jìn)行性減少，且結(jié)腸動力功能出現(xiàn)障礙，而補(bǔ)充外源性5-HT可以改善糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙，但不能抑制血糖升高。這些結(jié)果提示，1型糖尿病外周5-HT水平的下降可能與結(jié)腸動力障礙有關(guān)，外源性5-HT改善腸道動力功能的作用機(jī)制有待探討。