白振東， 李培昕， 張寧彥， 程 健， 張 敬， 張 軍

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 上海 200092)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是最為原始的干細(xì)胞，來(lái)源于哺乳動(dòng)物囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。目前，理論上認(rèn)為ESCs具有自我更新和分化成所有主要細(xì)胞系的能力[1]，因此，ESCs具有廣泛的應(yīng)用前景。ESCs的自我更新能力是受到嚴(yán)格調(diào)控的，Oct4、Sox2和Nanog被認(rèn)為是多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子[2]。Sympk能夠與Oct4相互作用，進(jìn)而促進(jìn)ESCs的自我更新和多能性[3]，而Sox2在ESCs自我更新過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用，并且它是產(chǎn)生可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的必要因素[4]。此外，Nanog能夠與Oct4和Sox2協(xié)同作用，以調(diào)控ESCs的全能性[5]。

microRNA(miRNA)是一種大小為20～25個(gè)堿基的非編碼小分子RNA。越來(lái)越多的研究表明，miRNA參與了干細(xì)胞特性的調(diào)控[6-7]。miRNA在干細(xì)胞自我更新、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝凋亡等一系列的生理活動(dòng)中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用[8-10]。已有研究表明，miR-294/miR-302能夠促進(jìn)ESCs的增殖，抑制其分化[11]。而miR-592通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化[12]，其在ESCs自我更新及分化過(guò)程中可能也發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。本研究以KO-miR-592 mESCs及正常mESCs為工具細(xì)胞，利用qRT-PCR及Western印跡法分析miR-592調(diào)控相關(guān)基因，從而在mESCs自我更新和分化過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)細(xì)胞株由同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院薛志剛教授贈(zèng)予；敲除miR-592的mESCs細(xì)胞株(KO-miR-592 mESCs)購(gòu)于美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校；mESCs培養(yǎng)基成分為DMEM、15% FBS、GlutaMAX、NEAA、LIF及β-Mercaptoetanol。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將5×105個(gè)mESCs接種在含有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時(shí)，采用XfectTMRNA轉(zhuǎn)染試劑(Clontech)將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至mESCs中。

1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)

吸除培養(yǎng)液，使用PBS溶液進(jìn)行清洗。加入4%的多聚甲醛，以固定細(xì)胞。去除多聚甲醛后，使用PBS進(jìn)行清洗。將封閉液加入細(xì)胞中，以進(jìn)行封閉。隨后加入一抗，在4℃下孵育過(guò)夜?；厥找豢购?，用PBS緩慢清洗。隨后封閉液清洗2次，封閉30min。加入二抗，在黑暗條件下孵育2h。回收二抗，使用DAPI進(jìn)行染色，在37℃黑暗下孵育15min。在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，并拍照。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)

使用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，進(jìn)而從細(xì)胞中提取總RNA，隨后測(cè)定RNA的濃度。借助RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃ 5s變性，60℃ 34s退火延伸，循環(huán)40次。

1.4 Western印跡法分析

在細(xì)胞中加入蛋白裂解液，以裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，利用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。制備蛋白樣品，配制電泳分離膠和濃縮膠，上樣并進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行封閉，在4℃冰箱里孵育一抗過(guò)夜。使用TBST溶液清洗3次，加入二抗，在室溫黑暗條件下放置50min?；厥斩?，再用TBST溶液清洗3次。最后，使用Odyssey紅外成像儀顯色，并進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析。

1.5 pSuper-miR-592及pSuper-miR-592 mut質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)miR-592前體序列和pSuper-EGFP1質(zhì)粒酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，具體如下。上游引物： 5′-GCGGATCCAGTTTCCAGAACACCCAGAT-3′；下游引物： 5′-GCAAGCTTAAAAAACGCACAAGC-ACGTCATAGA-3′。擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物插入pSuper-EGFP1質(zhì)粒的BamHⅠ/HindⅢ酶切位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建pSuper-miR-592質(zhì)粒。利用QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)構(gòu)建miR-592種子區(qū)突變的表達(dá)質(zhì)粒pSuper-miR-592 mut。將pSuper-EGFP1質(zhì)粒用作轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部對(duì)照。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

擴(kuò)增miR-592與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列片段，進(jìn)而插入螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Control中，以構(gòu)建重組質(zhì)粒。隨后，將海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK，與上述重組質(zhì)粒及pSuper-EGFP1或pSuper-miR-592或pSuper-miR-592 mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，分別檢測(cè)各組中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，以分析熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞全能性的鑒定

將mESCs和KO-miR-592 mESCs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以鑒定其全能性，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞中全能性相關(guān)基因Nanog、Sox-2及Oct-4均高表達(dá)(圖1)，表明實(shí)驗(yàn)使用的mESCs及KO-miR592 mESCs均處于未分化狀態(tài)，具有全能性。

圖1 小鼠胚胎干細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×100)Fig.1 Immunocytochemical staining of mouse embryonic stem cells(×100)

2.2 qRT-PCR分析miR-592對(duì)mESCs分化的影響

設(shè)立正常mESCs組、過(guò)表達(dá)miR-592 mESCs組及KO-miR-592 mESCs組，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常mESCs相比，過(guò)表達(dá)miR-592組中miR-592表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，而KO-miR-592 mESCs組中miR-592的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖2A,P<0.01)。與此同時(shí)，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析了3組細(xì)胞中內(nèi)胚層標(biāo)志性基因AFP和GATA6，中胚層標(biāo)志性基因α-SMA和Brachyury及外胚層標(biāo)志性基因Nestin和Neurofilament在mRNA水平的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常mESCs組相比，過(guò)表達(dá)miR-592組外胚層標(biāo)志物Neurofilament表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，Nestin的表達(dá)水平有上調(diào)的趨勢(shì)，而AFP、GATA6及α-SMA的表達(dá)則顯著下調(diào)(圖2B,P<0.05)。而在KO-miR-592 mESCs組中結(jié)果則相反，與對(duì)照組相比，KO-miR-592 mESCs組中Neurofilament和Nestin的表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，而AFP和GATA6的表達(dá)則顯著增加(圖2B,P<0.05)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-592能夠促進(jìn)mESCs向外胚層的分化，特別是神經(jīng)方向。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中miR-592及三胚層 分化標(biāo)志性基因的表達(dá)情況Fig.2 Detection of miR-592 and three germ layer differentiation marker genes in different experimental groups by qRT-PCRA： miR-592表達(dá)水平；B： 三胚層分化標(biāo)志性基因表達(dá)水平；與對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01

2.3 Western印跡法驗(yàn)證miR-592對(duì)mESCs分化的影響

通過(guò)Western印跡法，在蛋白水平上驗(yàn)證miR-592對(duì)mESCs分化的影響。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-592組外胚層標(biāo)志蛋白Nestin的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，而內(nèi)/中胚層標(biāo)志蛋白AFP及α-SMA的表達(dá)均顯著降低(圖3,P<0.05)。而與正常對(duì)照組相比，KO-miR-592 mESCs組中Nestin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，AFP和α-SMA的表達(dá)則顯著升高(圖3,P<0.05)。蛋白水平上的檢測(cè)結(jié)果與mRNA水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-592能夠促進(jìn)mESCs向外胚層方向的分化，而敲除miR-592的mESCs則更傾向于向內(nèi)/中胚層方向分化。

圖3 Western印跡法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中 三胚層標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Detection of the expression of the three germ layer marker proteins in different experimental groups by Western blottingA： Western印跡法；B： 蛋白表達(dá)的灰度分析；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-592作用的靶基因

利用TargetScan生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http：∥www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)miR-592作用的靶基因，結(jié)果顯示Cep135為miR-592作用的潛在靶基因(圖4)，而且已有研究發(fā)現(xiàn)Cep135與胚胎干細(xì)胞的自我更新緊密相關(guān)[13]。

圖4 利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-592作用的靶基因Fig.4 Analysis of miR-592 target gene with TargetScan database

2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-592作用的靶基因

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cep135是否為miR-592作用的靶基因，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行分析。根據(jù)預(yù)測(cè)的Cep135與miR-592結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并將包含miR-592結(jié)合位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pGL3-Control載體，以構(gòu)建pGL3-Control-3′UTR Cep135重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒，分別與pSuper-EGFP1或pSuper-miR-592或pSuper-miR-592 mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，以設(shè)立對(duì)照組、miR-592組和miR-592 mut組，轉(zhuǎn)染48h后，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-592組中熒光素酶活性顯著降低(圖5,P<0.05)，進(jìn)而證實(shí)Cep135是miR-592作用的靶基因。此外，利用Western印跡法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中Cep135蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-592組中Cep135蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖6,P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-592能夠靶向抑制Cep135的表達(dá)。

圖5 miR-592與Cep135 3′UTR相互作用Fig.5 The interaction between miR-592 and 3′ UTR of Cep135 與對(duì)照組相比，*P<0.05

圖6 Western印跡法檢測(cè)miR-592轉(zhuǎn)染后 細(xì)胞中Cep135的表達(dá)變化Fig.6 Detection of the expression of Cep135 after miR-592 transfection by Western blottingA： Western印跡法；B： 蛋白表達(dá)的灰度分析；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.6 Cep135對(duì)mESCs自我更新的影響

Cep135基因能夠編碼中心體蛋白，且與干細(xì)胞的自我更新密切相關(guān)。在mESCs中干擾Cep135或過(guò)表達(dá)Cep135，以探究Cep135對(duì)mESCs自我更新能力的影響。Western印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾Cep135的表達(dá)后，mESCs中Oct-4、Sox-2和Naong 3種干性標(biāo)志物的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而過(guò)表達(dá)Cep135后，3種蛋白的表達(dá)水平則顯著增加(圖7,P<0.05)，表明過(guò)表達(dá)Cep135能夠促進(jìn)mESCs的自我更新。

圖7 Western印跡法檢測(cè)Cep135轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 自我更新關(guān)鍵因子的表達(dá)情況Fig.7 Detection of the expression of key factors of self- renewal after Cep135 transfection by Western blottingA： Western印跡法；B： 蛋白表達(dá)的灰度分析；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.7 miR-592靶向Cep135以抑制mESCs的自我更新

利用Western印跡法分析miR-592在mESCs自我更新過(guò)程中所發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在mESCs中過(guò)表達(dá)miR-592促使Oct-4、Sox-2和Naong的表達(dá)量顯著降低(圖8,P<0.05)。而當(dāng)同時(shí)上調(diào)miR-592和Cep135的表達(dá)時(shí)，與過(guò)表達(dá)miR-592組相比，Oct-4、Sox-2和Naong的表達(dá)水平有所恢復(fù)(圖8)。此外，本研究已經(jīng)證明Cep135是miR-592作用的靶基因，且Cep135能夠促進(jìn)mESCs的自我更新，說(shuō)明miR-592可能通過(guò)靶向下調(diào)Cep135的表達(dá)，以抑制mESCs的自我更新，進(jìn)而促使mESCs向外胚層方向分化。

3 討 論

胚胎干細(xì)胞自我更新及分化過(guò)程中具體調(diào)控機(jī)制的研究已然成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，這也是ESCs被廣泛應(yīng)用于臨床治療的前提條件。目前已發(fā)現(xiàn)一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，轉(zhuǎn)錄因子等能夠參與調(diào)節(jié)ESCs的自我更新和分化過(guò)程[14-15]。ESCs干性維持的相關(guān)信號(hào)通路包括Erk/Mapk、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin及LIF/JAK/STAT3等[5,16]，這些信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)ESCs中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Nanog、Sox2和c-Myc)的表達(dá)，從而發(fā)揮作用。此外，這些信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子能夠與miRNA相互作用，進(jìn)而形成一個(gè)調(diào)控ESCs自我更新與分化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。已報(bào)道m(xù)iR-145抑制Sox2的表達(dá)，進(jìn)而抑制人胚胎干細(xì)胞的自我更新[17]。而miR-221-3p和miR-221-5p均能夠靶向Oct4、Nanog和Sox2，以抑制mESCs的多能性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在mESCs中miR-592通過(guò)調(diào)控Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)變化，進(jìn)而抑制mESCs的自我更新。

圖8 Western印跡法檢測(cè)miR-592轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 自我更新關(guān)鍵因子的表達(dá)情況Fig.8 Detection of the expression of key factors of self- renewal after miR-592 transfection by Western blottingA： Western印跡法；B： 蛋白表達(dá)的灰度分析；與對(duì)照組相比，*P<0.05

關(guān)于miR-592具體通過(guò)作用下游哪些關(guān)鍵分子發(fā)揮調(diào)控作用一直是研究的熱點(diǎn)。借助生物信息學(xué)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，本研究證實(shí)Cep135為miR-592作用的靶基因。Cep135能夠編碼中心體蛋白，而中心體不對(duì)稱性與干細(xì)胞的自我更新緊密有關(guān)[13]。此外，Cep135對(duì)于微管的形成也是必需的[19]，進(jìn)而在細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)的維持及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Cep135的表達(dá)能夠促進(jìn)mESCs的多能性，而miR-592能夠靶向下調(diào)Cep135，從而抑制mESCs的自我更新，并促使mESCs向外胚層方向分化，特別是神經(jīng)方向。與此同時(shí)，已有研究報(bào)道m(xù)iR-592在大鼠腦組織中特異表達(dá)，而且其表達(dá)量在胚胎期逐漸增加，在胚胎期E18時(shí)達(dá)到最高峰[12,19]。這提示在胚胎期表達(dá)升高的miR-592可能通過(guò)調(diào)控胚胎干細(xì)胞的自我更新與分化，從而促進(jìn)外胚層特別是神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，進(jìn)一步表明miR-592可能在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中扮演了關(guān)鍵的角色，但關(guān)于miR-592在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的具體調(diào)控作用和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

另一方面，已有研究報(bào)道移植ESCs可用于神經(jīng)退行性疾病的治療研究[20]，而部分miRNA在ESCs神經(jīng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[21]，將此類miRNA與ESCs聯(lián)合作用，進(jìn)而能夠改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療效果。通過(guò)進(jìn)一步探索miR-592在ESCs自我更新和分化過(guò)程中的作用及分子機(jī)制，以調(diào)控miR-592的表達(dá)水平，促使ESCs向神經(jīng)方向分化，進(jìn)而改善移植ESCs的神經(jīng)修復(fù)效果，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的策略。

綜上所述，miR-592能夠靶向下調(diào)Cep135的表達(dá)，以抑制mESCs的自我更新，進(jìn)而促使其向外胚層方向分化，表明miR-592在mESCs自我更新和分化過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，而且提示miR-592與胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育之間存在著一定的聯(lián)系。