李 莉， 劉 潔， 艾貴海， 秦錦龍， 丁金曄， 程忠平

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致婦女癌癥相關(guān)性死亡的第5大原因[1]。盡管經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)研究和臨床研究多年來(lái)的共同努力，卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在25%～30%，是致死率最高且預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性生命的健康[2]。然而，對(duì)于卵巢癌的病理發(fā)生機(jī)制至今尚未明確。

炎癥是癌癥的重要特征，越來(lái)越多的研究表明炎性微環(huán)境參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。腫瘤微環(huán)境中存在大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils, TANs)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)。它們通過(guò)自分泌和旁分泌產(chǎn)生的炎性因子及趨化因子等激活炎性信號(hào)形成動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)激活多種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8等)、趨化因子、蛋白水解酶(基質(zhì)金屬蛋白酶9、中性粒細(xì)胞蛋白酶、組織蛋白酶等)以及細(xì)胞表面受體(Toll樣受體等)，使細(xì)胞外基質(zhì)的降解，刺激新生血管形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[5-6]。

卵巢癌的起源及發(fā)生機(jī)制目前尚未明了。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的醫(yī)學(xué)背景下，探索炎性微環(huán)境與卵巢癌病理發(fā)生機(jī)制之間的聯(lián)系，為卵巢癌的靶向治療提供新的研究思路[7-8]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與炎性病理機(jī)制密切相關(guān)，并且?guī)缀跎婕奥殉材[瘤發(fā)展的各個(gè)階段[9-10]。傳統(tǒng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，卵巢排卵期間卵巢濾泡附近的上皮細(xì)胞廣泛增殖、破壞和凋亡，導(dǎo)致卵泡壁的破裂損傷和隨后重塑修復(fù)，最終導(dǎo)致潛在的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞基因突變；據(jù)推測(cè)，卵巢排卵過(guò)程會(huì)引起氧化應(yīng)激、增加炎性相關(guān)因子的濃度[11]；還有研究表明卵巢癌的發(fā)生與輸卵管起源和盆腔炎性疾病相關(guān)[12]。炎癥及炎性介質(zhì)與卵巢癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、化學(xué)耐藥及不良預(yù)后密切相關(guān)[13-15]。然而，炎性微環(huán)境中的炎性相關(guān)因子在卵巢癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制仍然不是很明確。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究炎性相關(guān)因子(TLR4外源性配體LPS和經(jīng)典炎性細(xì)胞因子TNF-α)對(duì)卵巢癌細(xì)胞炎性增殖增生信號(hào)的表達(dá)，以及與卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix meta-lloproteinase-9， MMP9)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase， NE)和組織蛋白酶G(cathepsin-G，Cath-G)的表達(dá)。探討腫瘤微環(huán)境中的炎性相關(guān)因子對(duì)卵巢癌胞內(nèi)信號(hào)及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

卵巢癌漿液性細(xì)胞系HEY購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；異丙醇、無(wú)水乙醇及氯仿購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)；脂多糖(LPS)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司(L2630)；Toll樣受體4(Toll-like receptors 4， TLR4)拮抗劑VIPER(NBP2-26244)購(gòu)自美國(guó)Novus公司；TNF-α購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech公司(300-01A)，TNF-α拮抗劑GSK2982772購(gòu)自美國(guó)Selleck公司(S8484)；一抗： Anti-TLR4(ab13556)、Anti-TNF-α受體1(TNFR1，ab19139)、Anti-TNFR2(ab109322)、Anti-NF-κB/p65(ab16502)、Anti-MMP9(ab38898)、Anti-NE抗體(ab68672)和Anti-Cath-G抗體(ab231149)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Anti-JNK(#9252)、Anti-p-JNK(#9251S)、Anti-p38(#8690)、Anti-p-p38(#9211)、Anti-ERK(#4695)、Anti-p-ERK(#4370)和Anti-GAPDH(#5174)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自上海碧云天公司；MMP9(XY-E11105)和NE(XY-E11079)ELISA試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技公司；Cath-G的ELISA試劑盒(IC-CTSG-Hu)購(gòu)自美國(guó)ImmunoClone公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

漿液性卵巢癌細(xì)胞系HEY采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。完全培養(yǎng)液中含10%的胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。細(xì)胞系置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，待卵巢癌細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%，按照1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。參考以往文獻(xiàn)選擇10ng/mL的LPS刺激卵巢癌細(xì)胞48h，2.5ng/mL的TNF-α處理細(xì)胞24h，設(shè)置該組為刺激組；采用10ng/mL的LPS加200nmol/L TLR4拮抗劑VIPER、2.5ng/mL的TNF-α加1nmol/L TNF-α拮抗劑處理細(xì)胞，該組為拮抗劑組；采用的培養(yǎng)液加入細(xì)胞中培養(yǎng)相同時(shí)間該組為對(duì)照組。于100倍光學(xué)顯微鏡下分別記錄刺激組、拮抗劑組和對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取和real-time PCR 采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR反應(yīng)根據(jù)以下條件擴(kuò)增： 95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 45s，共40個(gè)循環(huán)。Real-time PCR引物見(jiàn)表1。采用ABI Prism 7300 SDS Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內(nèi)參比較目的基因的表達(dá)高低。

表1 Real-time PCR的引物

1.3.2 Western印跡法 分別收集3組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4℃，12000r/min，離心半徑8cm，離心15min，抽提蛋白并用BCA試劑進(jìn)行蛋白定量后儲(chǔ)存于-80℃的冰箱中。將樣品中的蛋白煮沸變性5min后，按15μL/孔蛋白量上樣，隨后將10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)上。5%脫脂奶粉(檢測(cè)磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉1h后加入相應(yīng)的一抗Anti-TLR4(1∶500)、Anti-TNFR1(1∶1000)、Anti-TNFR2(1∶1000)、Anti-NF-κB/p65(1∶1000)、Anti-JNK(1∶1000)、Anti-p-JNK(1∶1000)、Anti-p38(1∶1000)、Anti-p-p38(1∶1000)、Anti-ERK(1∶1000)、p-ERK(1∶1000)、Anti-MMP9(1∶500)、Anti-NE(1∶500)、Anti-Cath-G(1∶500)和Anti-GAPDH(1∶2000)，置于4℃冰箱過(guò)夜。洗滌后加入二抗(1∶1000)，室溫封閉1h后，采用化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)顯影，并使用Tanon-5200成像系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值。

1.3.3 ELISA 分別收集3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照MMP9、NE和Cath-G的ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液中MMP9、NE和Cath-G在450nm波長(zhǎng)處各孔的去密度值(D450)。根據(jù)MMP9、NE和Cath-G的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及各孔去密度值計(jì)算每孔相應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 炎性相關(guān)因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞增殖信號(hào)mRNA的表達(dá)及蛋白的激活

采用real-time PCR檢測(cè)LPS和TNF-α刺激細(xì)胞增殖信號(hào)mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示： 與對(duì)照組比較，在經(jīng)10ng/mL的LPS處理48h的卵巢癌細(xì)胞和2.5ng/mL的TNF-α處理24h的卵巢癌細(xì)胞中，炎性因子在促進(jìn)自身受體(TLR4、TNFR1、TNFR2)mRNA表達(dá)的同時(shí)還誘導(dǎo)炎性增殖信號(hào)(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)的表達(dá)(P<0.01)，并且該增殖信號(hào)應(yīng)答可分別被LPS受體拮抗劑和TNF-α受體拮抗劑所抑制(P<0.01)，見(jiàn)圖1A、圖1B。Western印跡法結(jié)果顯示： 與對(duì)照組相比，在LPS和TNF-α處理卵巢癌細(xì)胞中，LPS和TNF-α的相應(yīng)受體以及增殖信號(hào)蛋白p-JNK1/2、p-p38、p-ERK1/2、NF-κB/p65的表達(dá)增加，而JNK1/2、p-38、ERK1/2的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1C、圖1D。此外，于100倍光鏡下分別記錄3組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，炎性相關(guān)因子LPS和TNF-α明顯刺激卵巢癌細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖2。

圖1 LPS和TNF-α對(duì)卵巢癌細(xì)胞中增殖信號(hào)mRNA及蛋白的影響Fig.1 The effect of LPS and TNF-α on the expression of cell proliferation signal mRNA and protein in ovarian cancer cells 與對(duì)照組及添加拮抗劑組比較，**P<0.01

圖2 LPS和TNF-α對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of LPS and TNF-α on cell proliferation in ovarian cancer cells

2.2 炎性相關(guān)因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞蛋白酶mRNA及蛋白的表達(dá)

分別采用real-time PCR、Western印跡法及ELISA檢測(cè)炎性相關(guān)因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞蛋白酶MMP9、NE和Cath-G的mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示： 與對(duì)照組比較，LPS和TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞蛋白酶(MMP9、NE和Cath-G)的mRNA及蛋白(包括細(xì)胞和上清液中的蛋白酶蛋白)的表達(dá)，該侵襲轉(zhuǎn)移信號(hào)可分別被LPS和TNF-α受體拮抗劑所抑制，見(jiàn)圖3。

3 討 論

炎癥是腫瘤公認(rèn)的標(biāo)志性特征，越來(lái)越多的研究表明慢性炎癥形成的腫瘤炎性微環(huán)境參與腫瘤的起始和進(jìn)展。在腫瘤微環(huán)境中，慢性遷延的炎癥狀態(tài)被形象的描述為“smouldering”，即“悶燃”或“悶燒”狀態(tài)[16]。局部免疫反應(yīng)和全身性炎癥反應(yīng)通過(guò)復(fù)雜的相互作用與腫瘤的進(jìn)展及患者的生存預(yù)后密切相關(guān)[17]。慢性炎癥通過(guò)誘導(dǎo)基因不穩(wěn)定性和基因突變、組織異常修復(fù)、細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；并且全世界癌癥患者中高達(dá)20%的病例與微生物感染相關(guān)[18-19]。此外，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中涉及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白水解包括尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑復(fù)合物、基質(zhì)金屬蛋白酶以及組織蛋白酶等在腫瘤中作為預(yù)后標(biāo)志物具有一定的臨床價(jià)值[20]。新近，越來(lái)越多的研究表明炎癥參與卵巢癌潛在的生物學(xué)機(jī)制[21]。然而關(guān)于炎性相關(guān)疾病與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)仍然不確定。

圖3 LPS和TNF-α對(duì)卵巢癌細(xì)胞中蛋白酶mRNA及蛋白的影響Fig.3 The effect of LPS and TNF-α on the expression of proteases mRNA and protein in ovarian cancer cellsLPS、TNF-α刺激后，卵巢癌細(xì)胞中蛋白酶(MMP9、NE、Cath-G)mRNA(A、B)，蛋白(C、D)的表達(dá)及細(xì)胞上清液中的蛋白酶的表達(dá)(E、F)；與對(duì)照組及添加拮抗劑組比較，P>0.05(ns)，**P<0.01

尚未有報(bào)道采用LPS刺激卵巢癌細(xì)胞觀察LPS對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響，因此，本研究選擇TLR4外源性配體LPS和經(jīng)典細(xì)胞因子TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞，并通過(guò)real-time PCR、Western印跡法和ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，證明了炎性相關(guān)因子LPS誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞炎性增殖信號(hào)(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)的激活，并促進(jìn)及腫瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用TLR4外源性配體LPS刺激子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞和子宮腺肌病間質(zhì)細(xì)胞能夠活化TLR4/NF-κB/p65信號(hào)途徑，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的炎性增殖并獲得侵襲表型[22-23]。本研究結(jié)果初步從細(xì)胞信號(hào)層面佐證了炎性相關(guān)因子LPS刺激能夠?qū)е侣殉舶┘?xì)胞表面受體TLR4表達(dá)增多，同時(shí)激活炎性增殖信號(hào)(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)及與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)的表達(dá)，且此效應(yīng)可被TLR4受體拮抗劑所抑制。

本研究結(jié)果與之前的研究報(bào)道相類(lèi)似。LPS作為T(mén)LR4信號(hào)的激活因子，通過(guò)激活NF-κB/p65信號(hào)通路在TLR4信號(hào)適應(yīng)蛋白MyD88的介導(dǎo)下，參與上皮性卵巢癌的炎性微環(huán)境和上皮性卵巢癌的化學(xué)耐藥[24]。Li等[25]采用組織化學(xué)染色研究500多名上皮性卵巢癌患者腫瘤中TLR4和MyD88相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，證明在上皮性卵巢癌的TLR4和MyD88高表達(dá)以及激活NF-κB/p65信號(hào)途徑，提示TLR4/MyD88/NF-κB/p65信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能導(dǎo)致炎性微環(huán)境的驅(qū)動(dòng)上皮性卵巢癌患者侵襲性表型和不良的臨床結(jié)果。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)TLR4外源性配體LPS刺激免疫細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)MAPKs信號(hào)(包括ERK、p38、JNK等)，進(jìn)一步誘導(dǎo)TLR4、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-8)和金屬蛋白酶增加(MMP1)[26]。在卵巢癌細(xì)胞和組織中ERK、p38、JNK高表達(dá)，且呈持續(xù)激活狀態(tài)，參與卵巢癌的進(jìn)展[27]。綜上，TLR4外源性配體LPS刺激卵巢癌細(xì)胞ERK、p38、JNK以及NF-κB/p65的激活，共同參與卵巢癌細(xì)胞的炎性微環(huán)境。總之，此次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TLR4外源性配體LPS作用于卵巢癌細(xì)胞，刺激NF-κB/p65和MAPKs信號(hào)的激活，佐證了TLR4激動(dòng)劑LPS刺激卵巢癌細(xì)胞炎性細(xì)胞增殖信號(hào)表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。

TNF-α作為急性和慢性炎癥的經(jīng)典炎性細(xì)胞因子在卵巢癌微環(huán)境中過(guò)表達(dá)，并通過(guò)刺激細(xì)胞因子、促血管生成因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展[28-29]。Choi等[30]發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)的激活刺激炎性細(xì)胞因子的釋放，并且與卵巢癌的進(jìn)展密切相關(guān)；TNF-α在卵巢癌血清和組織的高表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)卵巢癌腫瘤微環(huán)境形成。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用經(jīng)典炎性細(xì)胞因子TNF-α刺激卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示TNF-α刺激受體TNFR1、TNFR2以及炎性增殖信號(hào)(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)和侵襲相關(guān)蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)的表達(dá)增加，卵巢癌細(xì)胞的炎性增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)可以被TNF-α受體抑制。與之前發(fā)現(xiàn)TNF-α通過(guò)NF-κB/p65信號(hào)參與卵巢癌腫瘤發(fā)生發(fā)展相似。

本研究發(fā)現(xiàn)，炎性相關(guān)因子影響卵巢癌細(xì)胞的炎性增殖增生信號(hào)及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的改變。本次實(shí)驗(yàn)研究存在許多局限性。此次研究?jī)H僅探索了炎性相關(guān)因子作用于卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞增殖信號(hào)及蛋白酶的關(guān)系，還需要進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究： 采用CCK-8或MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)炎性細(xì)胞因子對(duì)卵巢癌細(xì)胞活性及細(xì)胞增殖的變化；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞在炎性因子刺激下的細(xì)胞遷移和侵襲能力；電鏡下觀察炎性因子刺激卵巢癌細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化、細(xì)胞程序性壞死及細(xì)胞凋亡等情況，從多方面驗(yàn)證炎性相關(guān)因子對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，還需要進(jìn)一步探索腫瘤微環(huán)境中的多種炎性相關(guān)因子協(xié)同作用與卵巢癌細(xì)胞信號(hào)及生物學(xué)行為的確切關(guān)系和調(diào)控機(jī)制；進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析及組織學(xué)分析(包括多重標(biāo)記染色)建立卵巢癌組織(包括卵巢癌組織學(xué)亞型)樣本中的炎性相關(guān)因子的表達(dá)與細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性。雷月等[31]的研究顯示，聯(lián)合檢測(cè)血清中腫瘤標(biāo)志物CA125、CA199和HE4可提高非良性卵巢癌早期檢測(cè)率，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步關(guān)聯(lián)卵巢癌血清炎性因子表達(dá)水平、臨床病理分期、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及生存時(shí)間等主要臨床參數(shù)，最終解釋炎性因子參與的腫瘤微環(huán)境與卵巢癌發(fā)生進(jìn)展以及生存預(yù)后的相關(guān)性，為卵巢癌的治療提供切實(shí)有力的科學(xué)依據(jù)。