王麗麗，唐 一，黃 艷，曹 穎，胡尚連

（1.西南科技大學(xué) 植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽621010）

竹是重要的非木本纖維資源，被廣泛應(yīng)用于制漿造紙、生物乙醇發(fā)酵以及板材制造等行業(yè)［1］。中國是世界上竹類資源最豐富的國家，竹林種類、面積和蓄積均居世界前列。目前，中國已形成了世界規(guī)模最大的竹產(chǎn)品加工制造產(chǎn)業(yè)，據(jù)國家林業(yè)局調(diào)查報(bào)告顯示，2018年，我國竹產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)2 456億元。然而，大部分竹產(chǎn)業(yè)還停留在竹的初級(jí)利用階段，隨著產(chǎn)業(yè)升級(jí)，對(duì)優(yōu)質(zhì)竹纖維的需求逐漸增大，但鑒于竹開花難、開花即死亡等生物學(xué)特點(diǎn)，傳統(tǒng)的遺傳育種方式改良竹纖維對(duì)于竹而言無法實(shí)現(xiàn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步以及基因組時(shí)代的來臨，利用基因工程手段開發(fā)創(chuàng)造新的竹種質(zhì)資源成為了近年來的研究熱點(diǎn)。

體細(xì)胞胚胎是植物離體再生的高效方式及遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，近年的研究發(fā)現(xiàn)，形態(tài)發(fā)生調(diào)控基因BABY BOOM（BBM）是一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子，能夠啟動(dòng)下游相關(guān)基因的響應(yīng)從而啟動(dòng)了體細(xì)胞胚胎的發(fā)生。很多學(xué)者將BBM基因看作是胚胎特有的基因或胚胎發(fā)生的標(biāo)志基因之一，該基因是啟動(dòng)和調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的開關(guān)［2］。該基因?qū)τ谥参矬w細(xì)胞胚的誘導(dǎo)等研究主要集中在楊樹、擬南芥等雙子葉植物上［3-4］；例如在辣椒中超量表達(dá)油菜BBM基因可以將僅0.03%的遺傳轉(zhuǎn)化效率提高提高至1%［5］；同樣的，在禾本科水稻、玉米等也有部分報(bào)道，研究認(rèn)為將其單獨(dú)超量表達(dá)可以將高玉米的轉(zhuǎn)化率從1.7%提高到34%，不同基因型提高的轉(zhuǎn)化率各不相同［6］。然而，該基因在竹中尚未被克隆，且對(duì)竹類植物離體再生以及遺傳轉(zhuǎn)化等方面的研究也未見報(bào)道。因此，本研究擬克隆慈竹BBM基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)分析以及相關(guān)激素處理后其表達(dá)模式分析等，為后續(xù)進(jìn)一步通過該轉(zhuǎn)錄因子提高該基因在竹中的遺傳轉(zhuǎn)化效率而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

采集梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）的筍（高30 cm，分為筍籜、筍基部和筍尖3個(gè)部分）、側(cè)芽、未展開葉和展開葉6個(gè)不同部位組織作為基因克隆和組織表達(dá)分析的試驗(yàn)材料。材料經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中保存。植物材料取自西南科技大學(xué)龍山教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。

激素誘導(dǎo)表達(dá)采用盆栽梁山慈竹實(shí)生苗，葉面噴施ABA（10 mg·L-1）、IAA（0.25 mg·L-1）NAA（0.1 mg·L-1）和MeJA（0.1 mmol·L-1），每個(gè)處理3株以上，對(duì)照則噴施自來水的，分別在處理時(shí)間0、1、2、4、6、10 h取枝條頂部第3片展開葉提取RNA，用于DfBBM基因表達(dá)量分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DfBBM基因克隆 從梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出1個(gè)BBM基因，使用NCBI＼＼Primer-Blast在線軟件設(shè)計(jì)全長引物（表1），以梁山慈竹筍的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物連接T載體后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，選擇陽性重組質(zhì)粒挑斑搖菌送華大基因測序。

1.2.2 DfBBM生物信息學(xué)分析 使用在線工具Conserved，ExPaSy中的ProtParam軟件理化性質(zhì)分析，用NCBI在線工具Conserved［7］對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析，用ExPaSy工具中的SOPMA軟件和SWISS-MODEL對(duì)BBM蛋白序列進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，使用http：／／www.dabi.temple.edu／disphos／進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測，使用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／進(jìn)行N型糖基化位點(diǎn)預(yù)測；使用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／YinOYang／進(jìn)行真核生物O型糖基化位點(diǎn)預(yù)測。用Mega7.0軟件，使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 梁山慈竹DfBBM 基因克隆和Real-time PCR分析所用引物Tab.1 Primers used in DfBBM gene cloning and real-time PCR analysis in D．farinosus

圖1 梁山慈竹DfBBM 基因克隆Fig.1 Cloning of DfBBM gene

1.2.3 DfBBM組織表達(dá)分析 以梁山慈竹Tublin基因作為內(nèi)標(biāo)，用NCBI＼＼Primer-Blast在線軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物。使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN）20μL體系說明加樣后，在IQ5 Multicolor RT-PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀上按照三部法進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)完成后分析溶解曲線，確認(rèn)無引物二聚體和非特異擴(kuò)增。每個(gè)樣品作3次重復(fù)，采用2-△△Ct法［8］計(jì)算不同組織部位的基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁山慈竹DfBBM 基因的克隆及鑒定

以梁山慈竹筍的cDNA為模板進(jìn)行克隆，獲得一條約1 100 bp的片段（圖1）。測序結(jié)果顯示，獲得的DfBBM基因的開放閱讀框長度為1 101 bp，編碼366個(gè)氨基酸（圖2）。

圖2 DfBBM 基因的核苷酸序列與氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of DfBBM

2.2 梁山慈竹DfBBM 進(jìn)化樹分析

以DfBBM的氨基酸序列為探針，通過NCBIBlast P程序檢索與DfBBM同源性較高的其他植物BBM序列：ZmBBM1（NP_001147535.1），ZmBBM2（ACG29578.1），PtBBM（XM_002316143），AtBBM（NM_121749.2），OsBBM1（AAX95437.1），RcBBM（EEF47356.1），RcBBM1（KC429673），RcBBM2（KC429674），BnBBM2（AF317905.1），BnBBM1（NM_121749.2），AtPLT1（NP_188720.2），AtPLT2（NP_175530.2），GmPLT2（NP_001234943.1），AeBBM1（XP_020174447.1），EtBBM（AQK38189.1）。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（建樹模型JTT+T）。如圖3所示，DfBBM與玉米的BBM2以及山羊草和旱麥草的BBM基因在一個(gè)分支上。

圖3 DfBBM 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of DfBBM genes from different plant species

2.3 DfBBM 基因的蛋白保守基序分析

對(duì)DfBBM 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)DfBBM 含有AP2結(jié)構(gòu)域，DfBBM，ZmBBM2，AeBBM1和EtBBM的AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)都含有2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域（圖4）。利用MEME［9］在線工具對(duì)梁山慈竹、野生稻和水稻基因編碼的蛋白序列進(jìn)行識(shí)別分析（圖5）?？?以 看 出BBM 和ZmBBM2，AeBBM1，EtBBM之間含有8個(gè)保守基序，這可能有助于研究DfBBM和其他物種BBM基因的相似功能。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，蛋白以無規(guī)則卷曲為主，含有31.15%的α-螺旋，8.2%的β-轉(zhuǎn)角，15.03%的延伸鏈和45.63%的無規(guī)則卷曲。從圖6可以看出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β轉(zhuǎn)角為主。梁山慈竹BBM基因理化性質(zhì)如表2所示，DfBBM基因編碼的酸性殘基多于堿性殘基。蛋白的親疏水性預(yù)測結(jié)果，推測DfBBM基因編碼的蛋白為親水性蛋白。從圖7和圖8看出DfBBM氨基酸序列可能存在26個(gè)磷酸化絲氨酸位點(diǎn)。DfBBM氨基酸序列可能有1個(gè)N型糖基化位點(diǎn)，6個(gè)O型糖基化位點(diǎn)。

圖4 DfBBM，Zm BBM 2，AeBBM 1和EtBBM 的AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of AP2 domains of DfBBM，ZmBBM2，AeBBM1 and EtBBM

圖5 DfBBM 蛋白保守基序分析Fig.5 The conserved motif analysis of DfBBM protein

表2 梁山慈竹DfBBM 理化性質(zhì)分析Tab.1 Physical and chemical properties of the protein encoded by DfBBM

圖6 BBM 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 BBM protein tertiary structure prediction

2.4 DfBBM 基因組織表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，DfBBM基因在展開葉中表達(dá)量最高，在筍尖的表達(dá)量高于筍基、籜和側(cè)芽，未展開葉中的表達(dá)量最低（圖9）。對(duì)梁山慈竹施加ABA、IAA、NAA和MeJA激素，發(fā)現(xiàn)在ABA、IAA和MeJA激素處理下，DfBBM 基因表達(dá)量都明顯升高，在NAA激素處理下，表達(dá)量明顯下降（圖10）。

3 討論

圖7 DfBBM 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測（“S”代表絲氨酸磷酸化位點(diǎn)）Fig.7 Phosphorylation site prediction of DfBBM protein（“S”stands for serine phosphorylation site）

圖8 DfBBM 糖基化位點(diǎn)預(yù)測Fig.8 Glycosylation site prediction of DfBBM

圖9 DfBBM 基因在不同組織中的表達(dá)Fig.9 qRT-PCR analysis of DfBBM gene in different tissues

植物離體再生是現(xiàn)代植物育種和作物生物技術(shù)的重要工具，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生途徑再生通常取決于外植體類型以及培養(yǎng)基中添加的植物生長調(diào)節(jié)劑，特別是植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度和比例等往往是離體再生成功與否的關(guān)鍵［10］。然而，不同植物個(gè)體差異以及遺傳背景相差很大，因此通過外源添加植物激素誘導(dǎo)不同物種離體再生經(jīng)常無法成功。人們對(duì)于離體再生過程中的遺傳基礎(chǔ)差異知之甚少，然而在植物體細(xì)胞胚或者不定芽形成過程中部分基因已經(jīng)被證實(shí)參與其中［11-14］。這些基因的大多數(shù)都是從擬南芥中克隆得到的，大部分編碼轉(zhuǎn)錄因子且參與植物體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等過程，過量表達(dá)其中的某些基因可以代替外源激素的使用，促使植物離體再生。例如LEAFY COTYLEDON1［13］， LEAFY COTYLEDON2［15］，WUSCHEL［14］以及BBM轉(zhuǎn)錄因子等均能促進(jìn)植物離體再生［16-17］。

圖10 DfBBM 基因在ABA、IAA、NAA和M eJA激素處理下的表達(dá)Fig.10 Relative transcript levels of DfBBM in response to ABA、IAA、NAA and MeJA

BBM基因最初是由油菜（Brassica napus）未成熟的花粉粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚分離而來，屬于AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因之一［16］。在油菜、擬南芥等模式植物中表達(dá)能形成體胚等結(jié)構(gòu)，同時(shí)可使外植體再生而不需要額外添加外源激素，研究者認(rèn)為該基因在體胚發(fā)生過程中能促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增和形態(tài)的發(fā)生［16］，是胚胎特有的基因或胚胎發(fā)生的標(biāo)志基因之一。BBM AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)擬南芥和油菜的胚胎細(xì)胞發(fā)育。BBM在體外和種子胚胎發(fā)生的早期階段以及在幼苗根分生組織中表達(dá)［18-19］。異位BBM在擬南芥中的表達(dá)可以誘導(dǎo)幼苗和外植體自發(fā)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和芽的發(fā)育，其在老組織如葉片中的表達(dá)可以誘導(dǎo)多效形態(tài)學(xué)改變。這些觀察結(jié)果提示BBM在促進(jìn)細(xì)胞增殖過程中的發(fā)育依賴作用。Li等［20］為了了解LkBBM轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，從落葉松基因組中總共獲得了4個(gè)2117 bp側(cè)翼片段，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)重要的順式作用元件，ROOTMOTIFTAPOX1元素（根特異性的元素），MYB1AT，MYBCORE，MYBPZM和MYBST1元素（元素參與MYB識(shí)別），ARFAT，AUXREPSIAA4和SURECOREATSULTR11元素（元素參與生長素響應(yīng)），ARR1AT元素（元素參與細(xì)胞分裂素反應(yīng)），CAREOSREP1，GARE1OSREP1，ATCCAOSAMY和PYRIMIDINEBOXHVEPB1元素（元素參與赤霉素響應(yīng)能力），MYB1AT和DPBFCOREDCDC3元素（參與脫落酸反應(yīng)的元素）。因此我們認(rèn)為BBM在行使功能時(shí)可能與各個(gè)激素密切相關(guān)，因此我們用ABA、IAA、NAA和MeJA激素對(duì)梁山慈竹進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)其對(duì)這幾種激素都有不同程度的響應(yīng)，其中對(duì)NAA激素處理與其他激素處理響應(yīng)不同，DfBBM基因表達(dá)量明顯下降。這表明DfBBM的側(cè)翼可能也具有與ABA、IAA、NAA和MeJA激素相關(guān)的順式作用元件，需要接下來對(duì)DfBBM基因側(cè)翼序列進(jìn)行克隆測序驗(yàn)證。

本研究克隆了梁山慈竹BBM基因，蛋白功能域預(yù)測分析表明DfBBM基因含有AP2結(jié)構(gòu)域，DfBBM的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)與乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子ERF096模型高度相似。研究發(fā)現(xiàn)ERF家族的基因編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物發(fā)育和生理過程中具有多種功能。MtSERF1是AP2／EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，Mantiri等［21］發(fā)現(xiàn)利用RNA干涉技術(shù)將該基因沉默后，轉(zhuǎn)基因苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率大大降低。Horstman A等［22］發(fā)現(xiàn)BBM可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控LEC1和LEC2，F(xiàn)USCA3（FUS3）和ABI INSENSITIVE3（ABI3）等基因。杜邦先鋒聯(lián)合巴斯夫和陶氏益農(nóng)公司在玉米中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的基因BBM和WUS2，超表達(dá)這兩個(gè)基因可提高轉(zhuǎn)化效率到25-50%［23］。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)DfBBM基因與玉米BBM基因聚為一簇，序列高度相似，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)DfBBM和ZmBBM2之間含有8個(gè)保守基序，這可能有助于DfBBM和ZmBBM2的相似功能。綜上推測DfBBM基因可能在細(xì)胞分裂、分化、增殖及胚胎發(fā)育方面有重要作用，如果超表達(dá)DfBBM能夠提高轉(zhuǎn)化效率，這將有助于解決目前竹子遺傳轉(zhuǎn)化效率較低的難題。