杜 暉，任 靜，范 菲，楊會鴿，鄭 妍

0 引言

復方炔雌醇甲羥孕酮膠囊是由炔雌醇、醋酸甲羥孕酮、維生素D2、維生素E和淫羊藿浸膏等制成，可用于雌激素水平下降和婦女更年期綜合征的對癥治療[1]。維生素D2和維生素E同屬脂溶性維生素，多采用氣相色譜法[2]和高效液相色譜法正向洗脫[3-4]測定。淫羊藿具有強筋骨、益精氣和補腎壯陽之功效[5]；而淫羊藿苷是其中一種最重要的類黃酮類有效成分[6]，有抗腫瘤[7]、增強性腺功能[8]和延緩衰老等[9]藥理學作用，多采用高效液相色譜法[10-11]和液質聯(lián)用[12-13]控制其含量。該藥品現(xiàn)行標準中采用2種色譜體系分別對其中醋酸甲羥孕酮和維生素E進行含量測定，缺少維生素D2和淫羊藿苷的質控指標。因此，建立一種能夠同時分析多種有效組分的方法尤為重要。本研究采用液相色譜梯度洗脫法，50 min內快速分離測定復方炔雌醇甲羥孕酮膠囊中淫羊藿苷、醋酸甲羥孕酮、維生素D2和維生素E等4種組分，為藥品質量標準的建立和完善提供依據。

1 儀器與試藥

戴安U3000高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(美國賽默飛世爾公司)；HC-3018R型低溫冷凍高速離心機(合肥科大創(chuàng)新股份有限公司)；Milli-Q Advantage超純水機(美國密理博公司)。

復方炔雌醇甲羥孕酮膠囊(復方制劑，由貴州神奇藥業(yè)提供，批號：180401、180402、180403)；醋酸甲羥孕酮(批號：100001-201305，純度99.6%)、維生素D2(批號：100155-201207，純度99.0%)、維生素E(批號：100062-201811，純度97.7%)和淫羊藿苷(批號：110737-201516，純度94.2%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純(美國霍尼韋爾公司)；其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 樣品溶液的制備 取本品20粒，精密稱定，計算平均裝量。取內容物，混勻，研細，精密稱取適量(約1粒內容物重)，置離心管中，精密加入甲醇25 ml，密塞，置水浴中超聲提取15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.45 μm濾膜過濾即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取維生素D224.12 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液①；精密稱取淫羊藿苷15.32 mg和醋酸甲羥孕酮33.40 mg，置50 ml量瓶中，精密加入對照品溶液①3 ml使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液②；精密稱取維生素E 154.08 mg，置10 ml量瓶中，加對照品溶液②溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液③；分別精密量取對照品溶液③0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，置50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱為Thermo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為乙腈，B為甲醇，C為純化水，具體比例如表1所示；柱溫為25 ℃；流速為1.0 ml/min；進樣量為10 μl；檢測波長為260 nm。

表1 流動相比例(%)

3 結果

3.1 專屬性考察 分別吸取空白溶劑、混合對照品和供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進行液相分析，記錄色譜圖如圖1所示，淫羊藿苷、醋酸甲羥孕酮、維生素D2和維生素E分別在6.1、17.7、35.4、40.3 min出峰，被分析物與干擾組分得到了有效的分離，分離度均大于1.5。

圖1 試劑空白(A)、混合對照品(B)和供試品溶液(C，批號：180401)的色譜圖

注：1.淫羊藿苷，2.醋酸甲羥孕酮，3.維生素D2，4.維生素E

3.2 線性范圍和檢測限的考察 精密量取“2.1.2”項所配置的淫羊藿苷、醋酸甲羥孕酮、維生素D2和維生素E的混合對照品溶液，按“2.2”項色譜條件進行液相分析，以峰面積Y(mAU·min)對樣品濃度X(μg/ml)進行線性回歸，相關系數(shù)均為1.000 0，如表2所示。當S/N約為3時，計算出4種組分的檢測限分別為0.3、0.6、0.6、1.2 ng。

3.3 重復性及穩(wěn)定性考察 將批號為180401的樣品溶液連續(xù)進樣6次，發(fā)現(xiàn)4種組分色譜峰面積的RSD值分別為0.56%、0.35%、1.05%、0.38%，證明該方法的重復性滿足實驗要求。將批號為180401的樣品溶液保存在4 ℃環(huán)境中，并在24、48、72 h后進樣分析，發(fā)現(xiàn)4種組分峰面積的RSD值分別為0.88%、1.25%、1.46%，樣品在72 h內保持穩(wěn)定。

3.4 回收率考察及樣品測定 按“2.1.1”項方法對樣品進行前處理，按“2.2”項色譜條件進行液相分析，測得3批復方炔雌醇甲羥孕酮膠囊中4種組分的含量。維生素D2的含量較標示量低，可能是在運輸、存儲的過程中發(fā)生了降解。

按“2.1.1”項方法向批號為180401的樣品中準確加入高、中、低3種濃度的標準溶液，每組濃度平行3份，計算回收率。結果顯示，平均回收率為96.8%～102.7%，相應的RSD為0.76%～2.43%。見表3、表4。

表2 四種組分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢測限

注：*維生素E線性范圍單位為mg/ml

表3 四種組分的回收率(n=9)

注：*維生素D2加入量和測得量的單位為μg

表4 樣品測定結果

4 討論

4.1 檢測波長的考察 醋酸甲羥孕酮的最大吸收波長為240 nm，淫羊藿苷的最大吸收波長為270 nm，維生素D2和維生素E的最大吸收波長為265 nm和285 nm?？紤]到維生素E的含量較高，為了兼顧到多組分的響應，我們將檢定波長設置為260 nm，此波長下4種組分均有較高的吸光值。

4.2 提取溶劑的考察 筆者比較了相同的超聲時間下，甲醇、甲醇-水(80∶20)和甲醇-水(50∶50)等3種溶劑的提取率和樣品出峰情況。試驗發(fā)現(xiàn)，甲醇-水(50∶50)提取，淫羊藿苷的提取率最高且峰形最好；但是維生素D2和維生素E屬脂溶性物質，在含水介質中無法溶出，提取率較低；甲醇作為溶劑可以兼顧所有目標成分的提取，從而滿足我們分析要求。

4.3 流動相的考察 由于淫羊藿苷和脂溶性維生素的極性差別較大，我們考慮采用一定比例的流動相梯度洗脫。由于初始狀態(tài)流動相的極性強于溶劑，導致淫羊藿苷峰形前沿嚴重，所以改用乙腈-水洗脫，后者峰形好于甲醇體系樣品；但是維生素E在乙腈體系中峰延展嚴重，故我們調整有機相比例，增大流動相中甲醇含量，25 min以后采用甲醇-乙腈(95∶5)洗脫，得到較為滿意的結果。

5 結論

復方炔雌醇甲羥孕酮膠囊原有標準及相關文獻中均無維生素D2和淫羊藿苷的含量測定，檢驗項目的合理性和全面性等方面存在較大缺陷。本文采用高效液相色譜法梯度洗脫對膠囊中4種組分進行了分離測定，將原本3個體系才能完成的分析任務大大簡化，縮短了分析時間，為該藥品安全有效的質控方法的建立提供了依據，結果亦能真正反映藥品的內在質量。