樊冬梅， 索娜， 劉潔明， 任寶琦

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；2.廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院消化科，廣東廣州510006；3.廣州中醫(yī)藥大學2018級碩士研究生，廣東廣州510006；4.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510021）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是原因不明的慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s disease，CD）。IBD病程遷延，反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1，2]。近年來，某些致病菌尤其是侵襲性大腸桿菌（adherent-invasive E.coli，AIEC）的入侵導(dǎo)致的腸上皮細胞（EICs）自噬功能障礙致胞內(nèi)細菌清除不足，進而引起啟動炎癥反應(yīng)通路激活，是腸道黏膜受損、炎癥反復(fù)發(fā)作的關(guān)鍵機制[3-7]。研究表明Atg16L1、Atg5等與IBD的發(fā)病密切相關(guān)，是控制自噬介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的重要自噬基因，其介導(dǎo)的腸上皮細胞自噬功能異常是IBD腸道炎癥啟動及復(fù)燃的關(guān)鍵[7，8]。感染AIEC后IECs通過上調(diào)miR-30c/130a表達、下調(diào)自噬基因Atg5、Atg16L1的表達引起細胞自噬功能下降而致胞內(nèi)致病菌清除不足[3-6]。因此，如何能維持適度的EICs自噬功能從而有效清除IBD相關(guān)致病菌對于IBD的預(yù)防、治療和轉(zhuǎn)歸極為重要。目前國內(nèi)許多學者主張益氣解毒法用于防治IBD的復(fù)發(fā)[9，10]。廣東省名中醫(yī)勞紹賢教授就是將本法成功用于IBD防治，臨床療效確切[11-13]。我們前期研究證實以此法為主的復(fù)方干預(yù)治療IBD可有效預(yù)防復(fù)發(fā)[11]，腸炎靈片作為醫(yī)院的院內(nèi)制劑應(yīng)用于防治IBD的臨床中取得了較好的療效，有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究進一步從干預(yù)致病菌入侵后腸上皮細胞自噬基因miR130a/ATG16L1表達的角度，探討益氣解毒方藥防治IBD的新途徑，為其進一步的臨床推廣提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與細菌HCT116細胞株，來自中國科學院細胞庫。福氏志賀菌GIM1.539標準菌株購自廣州微生物研究所。

1.2 動物SPF級SD大鼠及SPF級鼠料，均購自廣東省實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：0602237。

1.3 藥物及制備 益氣解毒方組成：黨參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，黃連10 g，救必應(yīng)30 g，白花蛇舌草30 g，烏藥30 g，炙甘草5 g。上述藥材飲片由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗中心藥理研究室鑒定并制成3 g·mL-1的中藥湯劑。

1.4 試劑與儀器DMEM高糖、雙抗、體積分數(shù)10%胎牛血清、胰酶（上海立菲生物技術(shù)有限公司）；ATG16L1抗體、二抗（美國Sigma公司）；總蛋白提取試劑盒（廣州市杏海生物科技有限公司）；Trizol、PCRMix Taq、溴乙錠（北京艾德萊公司）；miR130a模擬物及反義模擬物（美國Sigma公司）；熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司）；瓊脂糖、PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）、RNAiso Plus（日本TAKARA公司）；GAPDH引物序列上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；ATG16L1上游5’-GAGCTGCTCCCGTGATGACT-3’，下游5’-CGCCACGTAACTGCCATCAG-3’；miR130a上游5’-AGGCCGCAGTGCAATGTT-3’，下游5’-GTGCAG GGTCCGAGGT-3’；引物合成，于上海生工生物工程有限公司完成。3K30型臺式高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；D1008低速離心機梯度（美國Scilogex公司）；D-8721PCR儀（杭州晶格公司）；NanoDrop2000超微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo Scientific公司）；CFX96熒光定量PCR儀、imark酶標儀、2211BR Trans-Blot（SD Cell轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDocTMXRS+成像儀（美國Bio-Rad公司）；TS-1脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.5 實驗方法

1.5.1 HCT116細胞株的培養(yǎng)和傳代 以1∶9比例（體積分數(shù)）配制的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL）。獲得細胞后，棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后棄上清液。加入2.5 g/L胰酶消化3min，輕輕吹打細胞致完全脫落，立即加入含血清的培養(yǎng)液形成細胞懸液。1 000 r/min離心5min后棄上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻細胞，后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，做好標記。于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞2 d。待HCT116細胞貼壁生長至80%以上棄掉培養(yǎng)基進行傳代，根據(jù)細胞狀態(tài)可1傳2。

1.5.2 中藥含藥血清制備 按照3 g·mL-1生藥濃度制取中藥湯劑原液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠飼養(yǎng)1周后開始灌胃，每只大鼠每天早9點、晚4點各灌胃1次，每次1.5mL，對照組灌服等量生理鹽水。自由進食水，及時補充鼠料。連續(xù)給藥7 d，第7天灌藥前禁食12 h。末次給藥2 h后，無菌環(huán)境下乙醚麻醉大鼠，采用腹主動脈采血法收集大鼠全血，靜置30min，血液以3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心15min，用0.22μm微孔濾膜無菌分離血清，56℃水浴，30min滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 miR130a轉(zhuǎn)染及沉默轉(zhuǎn)染 使用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，將細胞鋪在24孔板中，使用脂質(zhì)體2000將熒光素酶報告載體同50 nmol/LmiR130a模擬物或相應(yīng)的陰性對照物共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，按照熒光強度與陰性對照組對照判斷轉(zhuǎn)染是否有效。以上述步驟中合成的目的片段為目的基因的反義基因作為miR130a反義模擬物進行沉默轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染都使用脂質(zhì)體2000，含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，將細胞鋪在24孔板中，使用脂質(zhì)體2000將熒光素酶報告載體同50 nmol/L miR130a反義模擬物或相應(yīng)的陰性對照物共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，按照熒光強度與陰性對照組對照判斷轉(zhuǎn)染是否有效。

1.5.4 福氏志賀菌GIM1.539標準菌株感染HCT116細胞模型的建立 福氏志賀菌GIM1.539標準菌株液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集細菌，用無抗生素DMEM高糖培養(yǎng)基制備細菌懸液，通過測定吸光度[D（600 nm）]值調(diào)整細菌濃度[1D（600 nm）=1×108CFU/mL]。以含體積分數(shù)10%小牛血清的DMEM高糖（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL）為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)HCT116細胞株培養(yǎng)2 d。待HCT116細胞貼壁生長至80%時，棄掉培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI，MOI=細菌數(shù)∶細胞數(shù)）為100∶1加入GIM1.539懸液，37℃、體積分數(shù)5%CO2的條件下共培養(yǎng)。入侵分析方法為在沒有抗生素的培養(yǎng)基孵化3 h，PBS沖洗細胞，含有100μg/mL慶大霉素在指定時間被加入培養(yǎng)基中，細胞被用1%Triton X-100溶解在脫離子水中，樣品持續(xù)稀釋并固定在瓊膠上，細菌的數(shù)量通過計數(shù)菌落形成單位（CFU）來確定。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測HCT116細胞中ATG16L1、LC3的蛋白表達 將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中，1 000 r/min離心10min，再用預(yù)冷PBS，1 000 r/min離心5min洗2次去除培養(yǎng)液。在每毫升冷裂解緩沖液中加入5μL磷酸酶抑制劑，1μL蛋白酶抑制劑和5μL PMSF（濃度200 mmol/L，溶于異丙醇），混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。在離心管的細胞中加入上述配制好的冷裂解緩沖液，5×106個細胞，加入量約為0.4mL，冰上操作，細胞與冷裂解緩沖液一同轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，置于4℃搖床平臺上；溫和振蕩15min，14 000 r/min，4℃離心15min，取上清為全蛋白提取物，蛋白定量后，分裝保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。按照試劑盒說明繪制標準曲線測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜，20 g/L白蛋白4℃封閉過夜后，依次加入一抗，4℃過夜，棄去一抗加入相對應(yīng)的二抗，ECL顯色，曝光、顯影、定影、拍照、掃描后通過BandScan軟件進行條帶灰度半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5.6 熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）法檢測HCT116細胞中miR130a、ATG16L1的RNA表達 以6×105/孔接種至6孔板中的細胞處理6 h后，以PBS漂洗細胞3次。每孔加入1mL Trizol，按照Trizol說明書提取總RNA。從-80℃冰箱中取出樣品RNA，于4℃解凍，然后在0.2mL PCR管中配制反應(yīng)溶液，37℃、42℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）進行cDNA的合成，SYBRGreen PCR，將PCR管置于定量PCR儀中進行反應(yīng)。

1.5.7 實驗分組 體外GIM1.539感染HCT116細胞模型建立后，根據(jù)添加的血清不同、干擾方案的不同分組，每次實驗每組設(shè)6個復(fù)孔。具體分組見表1。

表1 細胞實驗分組Table 1 The grouping in the cell test

1.6 統(tǒng)計方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，首先對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性分析。樣本例數(shù)較?。╪=6），對于組內(nèi)差異比較，若服從正態(tài)分布且方差齊性，則選用單因素方差分析；對于組間差異比較，若服從正態(tài)分布且方差齊性，采用獨立樣本t檢驗，否則選用秩和檢驗。檢驗結(jié)果以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot法檢測HCT116細胞中ATG16L1、LC3的蛋白含量 各組細胞轉(zhuǎn)染成功并接受干預(yù)完成后，用Western Blot法檢測各組細胞內(nèi)的ATG16L1、LC3蛋白含量水平，電泳結(jié)果見圖1、2，其灰度值結(jié)果見表2、表3。結(jié)果顯示：含藥血清干預(yù)方式與無藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組ATG16L1、LC3蛋白含量均較空白轉(zhuǎn)染組明顯減少（P＜0.05）；含藥血清干預(yù)方式與無藥血清干預(yù)方式miR130a反義模擬物組ATG16L1、LC3蛋白含量較空白轉(zhuǎn)染組均明顯增多（P＜0.05）；含藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的ATG16L1、LC3蛋白含量均較同組無藥血清干預(yù)方式的含量多（P＜0.05）。除此之外，無論何種干預(yù)方式，miR130a模擬物或反義模擬物的陰性對照物組的ATG16L1、LC3蛋白含量均與空白轉(zhuǎn)染組無明顯差異。

2.2 熒光定量PCR法檢測HCT116細胞中miR130a、ATG16L1的基因表達2組細胞轉(zhuǎn)染成功并接受干預(yù)完成后，用熒光定量PCR法檢測各組細胞中的miR130a、ATG16L1的基因表達水平，結(jié)果見表4、5。結(jié)果顯示：含藥血清與無藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組分別與本組空白轉(zhuǎn)染組比較，miR130a模擬物組miR130a的基因表達明顯上升（P＜0.05），而ATG16L1的基因表達明顯下降（P＜0.05）；含藥血清與無藥血清干預(yù)方式miR130a反義模擬物分別與本組空白轉(zhuǎn)染組比較，miR130a反義模擬物組miR130a的基因表達明顯下降（P＜0.05），ATG16L1的基因表達明顯上升（P＜0.05）；而含藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的miR130a基因表達均較同組無藥血清干預(yù)方式的下降（P＜0.05），而ATG16L1基因表達均較同組無藥血清干預(yù)方式的上升（P＜0.05）。

圖1 含藥血清干預(yù)的HCT116細胞中ATG16L1、LC3蛋白表達Figure 1 The protein expression of ATG16L1 and LC3 in HCT116 cells intervened by drug-containing serum

圖2 無藥血清干預(yù)的HCT116細胞中ATG16L1、LC3蛋白表達Figure 2 The protein expression of ATG16L1 and LC3 in HCT116 cells intervened by drug-free serum

表2 2種不同干預(yù)方式下各組HCT116細胞ATG16L1蛋白含量比較Table 2 Comparison of the protein content of ATG16L1 in HCT116 cells of various groups after2 types of intervention（，n=6）

表2 2種不同干預(yù)方式下各組HCT116細胞ATG16L1蛋白含量比較Table 2 Comparison of the protein content of ATG16L1 in HCT116 cells of various groups after2 types of intervention（，n=6）

①P＜0.05，含藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較；②P＜0.05，無藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

組別 含藥血清 無藥血清F值P值空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組0.67±0.07 0.70±0.07 0.30±0.05①0.73±0.08 1.67±0.03①0.16±0.02 0.24±0.01 0.09±0.01②0.17±0.02 0.53±0.01②322.461 253.241 95.266 286.560 7 120.496 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001

表3 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞LC3蛋白含量比較Table 3 Com parison of the protein contentof LC3 in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention（，n=6）

表3 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞LC3蛋白含量比較Table 3 Com parison of the protein contentof LC3 in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention（，n=6）

①P＜0.05，含藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較；②P＜0.05，無藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

組別空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組含藥血清0.71±0.07 0.77±0.07 0.29±0.05①0.76±0.09 1.81±0.04①無藥血清0.24±0.18 0.30±0.14 0.13±0.10②0.27±0.25 0.75±0.04②F值29.000 45.980 10.476 16.329 25.081 P值P＜0.001 P＜0.001 P=0.009 P=0.002 P=0.001

表4 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞m iR130a的基因表達比較Table 4 Com parison of the gene expression ofm iR130a in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention（，n=6）

表4 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞m iR130a的基因表達比較Table 4 Com parison of the gene expression ofm iR130a in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention（，n=6）

①P＜0.05，含藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較；②P＜0.05，無藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

組別空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組含藥血清0.85±0.02 0.87±0.02 3.26±0.03①0.99±0.06 0.23±0.01①無藥血清1.06±0.05 1.03±0.04 4.06±0.11②1.21±0.07 0.29±0.02②F值97.872 93.223 274.140 34.210 32.066 P值P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001

表5 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞ATG16L1的基因表達比較Table 5 Com parison of the gene expression of ATG16L1 in HCT116 cells ofvarious groups after 2 types of intervention（，n=6）

表5 2種干預(yù)方式下各組HCT116細胞ATG16L1的基因表達比較Table 5 Com parison of the gene expression of ATG16L1 in HCT116 cells ofvarious groups after 2 types of intervention（，n=6）

①P＜0.05，含藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較；②P＜0.05，無藥血清干預(yù)方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

組別 含藥血清 無藥血清F值P值空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組1.01±0.03 1.02±0.03 0.38±0.02①1.05±0.03 2.67±0.06①0.83±0.02 0.84±0.02 0.24±0.02②0.86±0.03 2.36±0.06②144.733 146.727 112.371 106.803 76.570 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001 P＜0.001

3 討論

某些致病菌尤其是AIEC入侵導(dǎo)致的腸道穩(wěn)態(tài)及免疫系統(tǒng)平衡被打破是腸道黏膜受損、炎癥反復(fù)發(fā)作的關(guān)鍵機制[2]。充分的證據(jù)顯示IBD患者腸道微生態(tài)紊亂，表現(xiàn)為潛在的有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌、厚壁菌數(shù)量的下降以及假定的致病菌如擬桿菌屬、大腸埃希桿菌數(shù)量的上升，并證實了在IBD患者回腸末端黏膜附著大量AIEC，能接近及入侵人IECs，導(dǎo)致IECs自噬能力下降，細菌復(fù)制，促使炎癥激活，不僅在IBD急性期，也是緩解期導(dǎo)致炎癥復(fù)發(fā)的主要因素。因此，IBD致病菌感染相關(guān)性細胞自噬功能障礙與IBD發(fā)病密切相關(guān)[3-6]。志賀菌屬又稱痢疾桿菌，是重要的侵襲性大腸桿菌之一[14]。目前國際上有采用志賀菌作為入侵菌進行入侵IECs探討IBD發(fā)生機制的研究[5，6，8]，因此，本研究采用志賀菌作為入侵菌進行研究。

自噬是真核生物普遍存在的自穩(wěn)機制，在胚胎發(fā)育、細胞自我保護和生存等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬參與胞內(nèi)微生物感染具有雙重作用：一方面，自噬能夠降解入侵的微生物，即以異源吞噬的方式清除胞內(nèi)的病原體；另一方面，有些微生物如IBD某些致病微生物能夠抑制細胞自噬而利于自身存活導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。人類全基因組關(guān)聯(lián)研究揭示，ATG和其他已知影響自噬過程的基因中的微小單核苷酸多態(tài)性位點，與克隆氏病的易感性有相關(guān)性[7]。ATG16L1在自噬小體形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，遺傳刪除ATG16L1能損害自噬小體的形成以及蛋白通過自噬途徑的清除，而且還導(dǎo)致TLR激動劑誘導(dǎo)的巨噬細胞促炎因子分泌的增強[15]，葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎加重[16]，ATG16L1基因表達在EICs和潘氏細胞，其基因突變誘導(dǎo)亦導(dǎo)致不能有效清除腸道細菌感染，引起腸黏膜炎癥啟動[17，18]。LC3是酵母自噬相關(guān)蛋白ATG8的哺乳動物同源基因，LC3翻譯后經(jīng)修飾形成主要位于胞漿中的LC3-Ⅰ，自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，定位于自噬體膜上，即LC3-Ⅱ。它在自噬小體的延伸和閉合過程中均發(fā)揮重要功能，其作為自噬體膜的重要組分，對于自噬的產(chǎn)生和檢測起著不可替代的作用。對于LC3調(diào)控的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄翻譯后的修飾水平，有研究發(fā)現(xiàn)IBD致病菌所致IECs自噬障礙通路可檢測到LC3的表達調(diào)控異常[4]。因此，也作為本研究評價細胞自噬功能指標之一。目前細胞自噬對IBD炎癥啟動的潛在作用已經(jīng)越來越明朗，細胞自噬與抗感染免疫密切相關(guān)，病原體導(dǎo)致的細胞自噬障礙是誘發(fā)炎癥反應(yīng)和炎癥性疾病的一個重要因素。新的研究已經(jīng)證明IBD相關(guān)病原體介導(dǎo)的自噬缺陷、病原體清除障礙和IBD發(fā)病機制之間存在相關(guān)性[4，5]。ATG介導(dǎo)的細胞自噬可清除降解細胞內(nèi)受損傷的細胞結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)細菌感染等，是重要的自噬蛋白。許多研究表明致病菌感染相關(guān)IBD自噬異?？赡芘c自噬蛋白調(diào)控缺陷有關(guān)，但其深入的機制可能與調(diào)控自噬的相關(guān)miRNAs有關(guān)[4，5，19]。最新研究[4，5，19]顯示，IBD相關(guān)致病菌AIEC感染后可通過上調(diào)miR130a表達下調(diào)自噬基因ATG16L1的表達，引起細胞自噬功能下降。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)ATG16L1基因存在miR130a的靶點。即miR130a可與靶ATG16L1基因的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，引起其降解或抑制其蛋白翻譯，推測miR130a可能通過該機制下調(diào)ATG16L1基因表達從而影響細胞自噬。

本研究通過對福氏志賀菌GIM1.539入侵HCT116人結(jié)腸癌上皮細胞模型進行miR130a模擬物、miR130a反義模擬物轉(zhuǎn)染，即miR130a過表達和沉默轉(zhuǎn)染，檢測細胞ATG16L1的蛋白含量以及基因表達，并與空白轉(zhuǎn)染組對照，同時分別對應(yīng)進行miR130a模擬物陰性對照物和miR130a反義模擬物陰性對照物轉(zhuǎn)染作為參照，證實自噬基因ATG16L1表達受miR130a調(diào)控。當細胞內(nèi)miR130a模擬物含量增多時，抑制ATG16L1基因表達，生產(chǎn)該蛋白的量減少，稱為過表達；而當細胞內(nèi)miR130a反義模擬物增多時，競爭性地與胞內(nèi)miR130a結(jié)合，從而使ATG16L1得到更多表達，稱為沉默。同樣原理，通過同時檢測細胞內(nèi)LC3自噬蛋白含量，結(jié)果顯示miR130a過表達時，LC3蛋白含量亦隨之減少；miR130a沉默時，LC3蛋白含量隨之增加。雖然LC3蛋白調(diào)控機制在本課題中未作深入研究，但是當miR130a過表達時，ATG16L1、LC3含量均減少，足以證實自噬小體的形成必然受阻，從而表明miRNAs/ATG網(wǎng)絡(luò)調(diào)控是影響細胞自噬的重要機制。

IBD病因復(fù)雜，被世界衛(wèi)生組織列為難治性疾病。2006年中醫(yī)消化病診療指南將本病劃歸中醫(yī)“痢疾”“腸澼”“腹痛”“便血”范疇。多數(shù)醫(yī)家[9，10]認為，IBD是在脾胃虛弱的基礎(chǔ)上感受寒、熱、濕毒之邪，傷于飲食勞倦或情志，致熱、濕、痰等邪客于腸道，阻滯氣血，腸絡(luò)失和，脂膜受損而發(fā)病。脾胃虛弱、運化失常是IBD發(fā)病過程中的內(nèi)在共性。鑒于此，國內(nèi)許多學者提出氣虛毒邪內(nèi)伏是IBD病情反復(fù)及復(fù)發(fā)的病機關(guān)鍵，并指出氣虛尤其脾氣虛是毒邪內(nèi)伏難以去除的主要原因，而毒邪多由風寒暑濕燥火侵犯人體后，深伏其中，纏綿不去，導(dǎo)致毒邪稽留，暗耗正氣，每于正氣虛弱或其他誘因觸發(fā)，屢發(fā)屢重，纏綿難愈，因此在治療上主張“益氣解毒為主”是IBD的防治大法[9，10]。中醫(yī)毒邪類似于致病菌，但IBD致病菌入侵后單純用清熱解毒方法治療效果卻不明顯，因此類致病菌可導(dǎo)致細胞自噬功能障礙，細菌清除不足，毒邪反復(fù)侵襲留存于體內(nèi)促使炎癥啟動及復(fù)發(fā)。那么，益氣解毒防治IBD復(fù)發(fā)的有效機制可能是干預(yù)細胞自噬障礙維持適度的細胞自噬功能促使毒邪（致病菌）外出，與中醫(yī)益氣促使毒邪外出理論不謀而合。自噬的自我調(diào)控功能與中醫(yī)“氣”相通。自噬的自我調(diào)控是有一定條件的，當細胞受到不良環(huán)境的刺激，通過激發(fā)一系列信號因子（目前科學界認為與miRNAs/Atg調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)）對自噬進行調(diào)控，這與中醫(yī)氣的推動和調(diào)控功能相似。中醫(yī)認為氣虛則動力不足、功能低下，氣盛則易生邪毒，而氣具有自我調(diào)節(jié)功能，若氣的調(diào)控作用正常，自噬既無太過，也無不及，細胞內(nèi)部各種功能活動則取得協(xié)調(diào)平衡，內(nèi)環(huán)境得到穩(wěn)定[20]。當正氣不足，氣的防御功能異常，細胞抗邪能力下降，自噬不足，外邪（致病菌）首先攻破人體免疫的第一道防線（入侵腸上皮細胞），繼而因正氣虛弱無法有效激活自噬網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，自噬相關(guān)基因低表達，無法清除胞內(nèi)菌和有害物質(zhì)，為炎癥的進一步發(fā)展提供了機會。故認為自噬障礙是中醫(yī)氣虛的表現(xiàn)。因此，推測益氣解毒法防治IBD復(fù)發(fā)的有效機制可能是通過干預(yù)細胞自噬障礙以扶正，助腸EICs促使毒邪（致病菌）清除而發(fā)揮作用?；诖?，構(gòu)建AIEC感染EICs體外模型，檢測益氣解毒方藥干預(yù)后胞內(nèi)自噬基因表達，從而探討miRNA/ATG調(diào)控通路，一方面可為闡明IBD通過自噬障礙引起炎癥復(fù)發(fā)的病理機制以及益氣解毒方藥干預(yù)途徑，另一方面可為揭示IBD中醫(yī)氣虛毒邪內(nèi)伏理論的科學內(nèi)涵提供新思路。

本院勞紹賢教授最早提出氣虛毒邪內(nèi)伏是IBD反復(fù)發(fā)作的病理機制，并以益氣解毒法為主制成了院內(nèi)制劑腸炎靈片在臨床推廣應(yīng)用40余年，取得了滿意療效。益氣解毒方（腸炎靈片）主要由黨參、白術(shù)、救必應(yīng)等藥物組成，其中：救必應(yīng)為冬青科植物鐵冬青的干燥樹皮或根皮，味苦、性寒，異名為白木香，始載于《嶺南采藥錄》，稱“白木香，味苦，清熱毒”，為我國南方地區(qū)民間慣用草藥，具有清熱解毒、消腫止痛、利濕、祛風解毒等功效；黨參溫補中焦、益氣補虛，具有健脾功效。在此基礎(chǔ)上加入黃連、白花蛇舌草、烏藥、木香，黃連配以白花蛇舌草擅清胃腸濕熱，加強清熱燥濕、澀腸止痢、瀉火解毒的功效；木香、烏藥辛散溫通，使方中有升有降，亦可健脾益氣，行氣止痛。本研究通過對體外福氏志賀菌GIM1.539感染HCT116細胞模型進行miR130a過表達和沉默轉(zhuǎn)染后，分別予以大鼠益氣解毒方含藥血清和大鼠無藥血清進行干預(yù)，檢測細胞LC3的蛋白含量、ATG16L1的蛋白含量和基因表達以及miR130a的表達進行對照。結(jié)果顯示，含藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的LC3蛋白、ATG16L1蛋白和基因表達均較同組無藥血清干預(yù)方式的表達增多。含藥血清干預(yù)方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的miR130a基因表達均較同組無藥血清干預(yù)方式下降。表明益氣解毒方藥可能是通過干預(yù)miR130a的基因表達使ATG16L1蛋白得到調(diào)控。研究結(jié)果同時證實了LC3自噬蛋白的含量有所提升。

綜上所述，益氣解毒方藥可能是通過抑制miRNAs的基因表達、上調(diào)ATG自噬基因的表達來維持腸上皮細胞自噬功能，從而有效清除胞內(nèi)菌控制IBD炎癥復(fù)發(fā)。但仍需進一步從自噬小體觀察、胞內(nèi)菌清除、炎癥因子、體內(nèi)實驗等方面證實。