李春 高運華 王治棟 黃文勝

摘要：選擇最常食用的海產(chǎn)對蝦作為蝦過敏源標準物質(zhì)的候選物，提取并純化其基因組DNA，采用序列測定法對設(shè)定的目標基因成分進行定性鑒定。用數(shù)字PCR技術(shù)精確確定海蝦16S基因、蝦真核生物18S基因、胡蘿卜真核生物18S基因的拷貝數(shù)，以胡蘿卜基因組DNA為本底，重量法配置蝦16S基因拷貝數(shù)滇核生物18S基因組拷貝數(shù)比值為1%。評定蝦16S基因拷貝數(shù)/真核生物18S基因拷貝數(shù)比值的定值不確定度，擴展不確定度為0.09%。并利用數(shù)字PCR儀對配置的標準物質(zhì)進行特性量值驗證，結(jié)果一致性良好?？蔀榛诤怂釞z測的食物過敏源標準物質(zhì)的研制提供方法參考。

關(guān)鍵詞：核酸檢測;蝦;過敏源;標準物質(zhì)

中圖分類號：TS207;Q52 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）09-0049-05

收稿日期：2019-02-15;收到修改稿日期：2019-03-31

基金項目：國家質(zhì)量研發(fā)重點專項項目（2017YFF0204604）;國家質(zhì)檢公益行業(yè)科研專項（201510026）;標準物質(zhì)平臺項目（32-APT1802-12）

作者簡介：李春（1994-），男，安徽長豐縣人，碩士研究生，專業(yè)方向為核酸定量分析。

通信作者：高運華（1972-），男，山東菏澤市人，副研究員，主要從事核酸計量技術(shù)與標準研究工作。

0 引言

為有效預(yù)防和控制食物過敏給人類健康帶來的危害，食物過敏源的檢測、診斷以及治療已成為國內(nèi)外研究的熱點[1-3]。檢測過敏源成分的方法主要有兩類，一是檢測過敏源蛋白質(zhì)，二是檢測過敏源基因殘留[4-6]。檢測過敏源蛋白質(zhì)方法直接，但是當過敏蛋白含量極低時，很容易被食品的基質(zhì)所掩蓋，同時不同過敏源之間有部分相同的抗原決定簇會發(fā)生一定的交叉反應(yīng)，容易造成檢測的誤差[7-8]。檢測過敏源基因殘留方法并不直接針對食品中的過敏源進行檢測，而是通過分析食品中是否還有該過敏源物種的基因成分，從而推測該產(chǎn)品是否含有該物種的過敏源[9-12]。我國發(fā)布過系列過敏源PCR檢測方法標準，該標準方法基于擴增反應(yīng)，靈敏度非常高，痕量的物種殘留即可檢出，為基于基因殘留檢測的過敏源檢測提供了方法標準[13-14]。但是，非常高的靈敏度，也使PCR檢測方法在某些產(chǎn)品上會出現(xiàn)假陽性，如大豆油作為大豆的油脂一般不含有大豆蛋白過敏源，但PCR方法也可以檢測出大豆基因的物種殘留，給出陽性判定。因此，檢測過敏源蛋白質(zhì)和檢測過敏源基因殘留兩種方法均有局限性，而法定的、具有特定量值的過敏源標準物質(zhì)是過敏源成分檢測結(jié)果準確有效保證。

食物過敏標準物質(zhì)是解決食物過敏檢測問題的關(guān)鍵材料之一。美國國家標準與技術(shù)研究院（NIST）研制了8種過敏性食物標準物質(zhì);歐盟資助的EuroPrevall項目構(gòu)建了一個食物過敏源信息的數(shù)據(jù)庫，而CREATE項目則首次證實重組花粉過敏源rBet v1可作為天然花粉過敏源Bet v1的候選標準物質(zhì)，為開發(fā)重組食物過敏源標準物質(zhì)提供了一種借鑒。國內(nèi)外基于過敏源殘留基因檢測的技術(shù)標準方法越來越多，但相對應(yīng)的標準物質(zhì)現(xiàn)在還不多，世界各國正積極研制相對應(yīng)的標準物質(zhì)。我國食物過敏源蛋白和核酸檢測的標準物質(zhì)研究正積極開展，食物過敏源標準物質(zhì)將為我國食物過敏源蛋白和核酸檢測結(jié)果的有效性、法制性和溯源性提供強有力的物質(zhì)和技術(shù)支撐。本文以最常食用的蝦為候選物，以胡蘿卜為本底，用數(shù)字PCR方法測定蝦和葫蘆卜特異基因拷貝數(shù)，重量法配制1%水平的蝦一胡蘿卜基因組標準物質(zhì)，利用數(shù)字PCR和熒光定量PCR方法對配制的標準物質(zhì)特性量值進行了驗證，為基于核酸檢測的食物過敏源標準物質(zhì)的研制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

冷凍干燥儀：熱電，Biosafer-18D，（美國）;數(shù)字PCR儀：Bio-Rad QX 200（美國）;實時熒光定量PCR儀：LightCycler 480Ⅱ（美國）;電子天平：梅特勒XSE 205DU（瑞士）：超速冷凍離心機：Sigma3K30（德國）;超純水系統(tǒng)：Milliber Q S（美國）。

1.2 材料試劑

基因組DNA提取試劑盒：天根生化DP323中國）;動物組織基因組DNA提取試劑盒：天根生化DP324（中國）：PCR擴增試劑盒：ABI4369016（美國）;數(shù)字PCR擴增試劑：Bio-Rad（美國）;數(shù)字PCR擴增試劑：Fluidigm Biomark qdPCR 37K^TMIFC（美國）;甲醇（色譜純）、乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）。

1.3 基因組DNA提取及純度分析

采用商業(yè)化提取試劑盒的技術(shù)方案提取基因組DNA，采用紫外分光光度法對基因組DNA含量（OD260吸收值）和DNA純度（OD260/OD280比值）進行了檢測;另外，利用瓊脂糖凝膠電泳方法對基因組DNA的完成性和相對含量進行了檢測。

1.4 數(shù)字PCR方法

通過文獻及國家現(xiàn)行標準的比較分析[13-14]，優(yōu)化建立了蝦過敏源標準物質(zhì)的PCR擴增條件和引物探針體系，用優(yōu)化建立的數(shù)字PCR擴增條件和反應(yīng)體系對蝦基因組DNA中目標基因片段，蝦和胡蘿卜基因組DNA中真核基因片段進行了定量擴增，用于標準物質(zhì)特性量值的確定、均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組提取DNA純化分析

以商品化的基因組DNA提取試劑盒為基礎(chǔ)，提取蝦和胡蘿卜的基因組DNA，利用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法對純化后的基因組DNA進行了純度分析，結(jié)果見表1和圖1。

由表1可知，純化后的基因組DNA OD260/OD280介于1.8～2.0之間，樣本純度較高;由朗伯比爾定律可知，DNA濃度與OD260紫外吸收值成正比，OD260吸收值1對應(yīng)于雙鏈DNA50ng/μL。提取的基因組DNA用數(shù)字PCR進行檢驗，沒有抑制效應(yīng)，可以用于標準物質(zhì)的定值分析。

分析圖1可知，提取的基因組DNA純度較高，蛋白質(zhì)和RNA殘留較少，滿足了定量PCR和數(shù)字PCR檢測的需要，可用于標準物質(zhì)定值分析。

2.2 目標基因擴增條件

通過文獻及國家現(xiàn)行標準的比較分析最終確定了蝦過敏源標準物質(zhì)的PCR擴增條件和引物探針體系[13-14]，PCR擴增熱循環(huán)條件：50℃ 2min;95℃變性、UNG酶失活10min;95℃變性15s，60℃退火延伸1min，50個循環(huán)。引榭朵針體系見表2，PCR反應(yīng)體系為TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）10μL;引物400nmol/L，1μL：探針400nmol/L，1μL：去離子水6μL;DNA模板2μL;總反應(yīng)體系20μL。

引物探針的特異性和靈敏度良好，熱循環(huán)條件合適，可以有效擴增出目標基因條帶。該反應(yīng)條件可用于標準物質(zhì)特性量值的定值確定和均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察。

2.3 標準物質(zhì)均勻性檢驗

均勻性是標準物質(zhì)的固有特性之一，即在規(guī)定的細分范圍內(nèi)其特性保持不變。按照國家計量技術(shù)規(guī)范JJF1343-2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》中對標準物質(zhì)均勻性評估的技術(shù)要求，隨機抽取15個包裝單元，用數(shù)字PCR方法檢測目標基因的拷貝數(shù)濃度進行標準物質(zhì)均勻性檢驗。采用F檢驗法對均勻性測量數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計檢驗，結(jié)果見表3。由表可知研制的標準物質(zhì)樣品均勻一致，符合標準物質(zhì)研制均勻性的要求。

2.4 標準物質(zhì)穩(wěn)定性考察

標準物質(zhì)的穩(wěn)定性是指在規(guī)定的時間間隔和環(huán)境條件下，標準物質(zhì)的特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)。過敏源標準物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗采用數(shù)字PCR方法進行測定。依據(jù)JJF1343-2012推薦的標準物質(zhì)穩(wěn)定性評價方法進行標準物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗及評價，檢驗結(jié)果見表4，分析可知在12個月時間內(nèi)標準物質(zhì)特性量值無顯著性變化，符合標準物質(zhì)的穩(wěn)定性要求，檢驗結(jié)果為穩(wěn)定。

2.5 標準物質(zhì)的定值

基因組DNA采用本文建立的數(shù)字PCR方法進行目標基因拷貝數(shù)的絕對定量檢測，確定了蝦16S基因和真核生物18S基因，葫蘆卜真核生物18S基因的拷貝數(shù)。依據(jù)JJF1343-2012的要求和ISO導(dǎo)則34的要求，采用重量法配制過敏源基因組DNA標準物質(zhì)，確定的標準值為拷貝數(shù)百分比值，為1%蝦16S滇核生物185=1%。

2.6 標準物質(zhì)的定值不確定度分析

定值結(jié)果不確定度主要從目標基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR定量、標準物質(zhì)的重量法配制、標準物質(zhì)的不均勻性、標準物質(zhì)的不穩(wěn)定性等部分進行了考察。具體考察分析的不確定度來源魚骨刺圖見圖2。

2.6.1 不確定度的量化

目標基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR測量不確定度（UM）主要包括數(shù)字PCR校準、儀器穩(wěn)定性、測量重復(fù)性3部分。儀器校準由校準證書得到，將其轉(zhuǎn)化為相對標準物質(zhì)不確定度計人標準物質(zhì)特性量值的不確定度，儀器的穩(wěn)定性和測量重復(fù)性由多次測量結(jié)果的相對標準偏差表示。標準物質(zhì)重量法配制和樣品的稀釋配制產(chǎn)生的不確定度（u_B）主要體現(xiàn)在天平稱量方面，主要包含天平本身的不確定度和多次稱量重復(fù)性兩部分。不均勻性帶來的不確定度（u_H）和不穩(wěn)定性帶來的不確定度（u_T）根據(jù)ISO導(dǎo)則35規(guī)定的計算方法進行計算。具體的量化結(jié)果見表5。

2.6.2 合成標準不確定度

以上不確定度分量互不相關(guān)，則合成標準不確定度為

蝦過敏源標準物質(zhì)合成標準不確定度為：u_{蝦16S/真核18S}=4.3%。

2.7 定值結(jié)果

定值結(jié)果表示為：標準值士擴展不確定度。取包含因子k=2，則擴展不確定度可以表示為U=k×u。蝦過敏源定值結(jié)果為1.01%±0.09%。

3 數(shù)字PCR驗證

將研制好的標準物質(zhì)用數(shù)字PCR方法進行了特性量值驗證，結(jié)果列于表6。

由表中數(shù)據(jù)可知，數(shù)字PCR的測量值與重量法配制值能夠很好的符合，由此說明，數(shù)字PCR進行目標基因拷貝數(shù)的精確定量，然后根據(jù)需要采用重量法配制成需要的不同目標基因比值的標準物質(zhì)是可行的。由于數(shù)字PCR方法是不依賴于外標準的絕對定量方法，現(xiàn)在越來越多的應(yīng)用到目標基因的定量分析中，也逐漸成為基于目標基因定量的核酸標準物質(zhì)權(quán)威定量方法;而重量法可以很好的實現(xiàn)設(shè)定基因比率樣本的配制，且選擇精度良好的天平可以有效減少重量法配制給標準物質(zhì)特性量值帶來的不確定度影響;因此，數(shù)字PCR和重量法結(jié)合很好的實現(xiàn)了不同物種間不同目標基因檢測標準物質(zhì)特性量值的確定，且準確度較高。

4 結(jié)束語

針對過敏源檢測急需的目標基因檢測標準物質(zhì)稀缺問題，本文研究建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的目標基因拷貝數(shù)濃度確定方法，測定了蝦16S基因和真核生物18S基因，葫蘆卜真核生物18s基因的拷貝數(shù)，然后利用重量法配制了蝦16S基因/真核生物18S基因DNA配比標準物質(zhì);評定了定值結(jié)果的不確定度，為基于目標基因檢測的過敏源標準物質(zhì)的研制提供了方法借鑒。

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（編輯：莫婕）