王孝盼 權(quán) 晟 陳利紅 鄭 捷

皮膚屏障破壞和繼發(fā)炎癥反應(yīng)是特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。部分特應(yīng)性皮炎患者的絲聚蛋白(Filaggrin，F(xiàn)LG)基因缺陷或脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因異常導(dǎo)致皮膚屏障破壞[2,3]，存在于表皮外的物質(zhì)如各種微生物作為變應(yīng)原更易與皮膚中豐富的免疫活性細(xì)胞接觸，誘導(dǎo)Th2型為主的炎癥反應(yīng)[4,5]。Th2細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子如IL-4和IL-13，抑制皮膚屏障功能結(jié)構(gòu)蛋白的基因表達(dá)，例如絲聚蛋白、兜甲蛋白等；抑制表皮脂質(zhì)分泌；下調(diào)抗菌肽LL-37，hBD2等進(jìn)一步損害屏障[6-8]。因此，皮損部位皮膚屏障的破壞和皮膚免疫炎癥反應(yīng)相互作用形成惡性循壞，AD的特征性臨床癥狀得以持續(xù)存在甚至加重。

保濕劑已廣泛用于AD的基礎(chǔ)治療，應(yīng)用保濕劑可以顯著減輕皮損程度甚至在痊愈后持續(xù)使用可以降低疾病復(fù)發(fā)率[9,10]。保濕劑通過增加皮膚角質(zhì)層的水合達(dá)到修復(fù)皮膚屏障的作用，因此，又被稱為“皮膚屏障修護(hù)劑”。補(bǔ)充含有適當(dāng)比例脂肪酸、神經(jīng)酰胺、膽固醇的保濕劑具有促進(jìn)皮膚通透屏障修復(fù)的作用[11]。保濕劑是AD的基礎(chǔ)治療，其機(jī)制主要是對(duì)AD受損的屏障進(jìn)行修復(fù)，而外用保濕劑調(diào)節(jié)皮膚炎癥作用機(jī)制尚未完全闡明。

我們推測(cè)富含LA-Cer的保濕劑兼具修復(fù)皮膚屏障和抗炎作用，從而抑制炎癥和皮膚屏障破壞間的惡性循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 卡泊三醇(calcipotriol/MC903)購自英國Tocris公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；Eastep? Super Total RNA Extraction Kit購自上海Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；SYBR Green PCR Master Mix購自美國Roche公司。Coneometer CM825購自德國CK公司，富含亞油酸-神經(jīng)酰胺的保濕劑玉澤皮膚屏障修護(hù)精華乳由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科與上海家化聯(lián)合股份有限公司聯(lián)合研制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 均購自Jackson Laboratory公司，6～8周齡雌性BALB/c小鼠。

1.3 分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只，隨機(jī)分為疾病組，治療組，對(duì)照組(EtOH)。疾病組鼠耳每天一次均勻涂抹2 nmol卡泊三醇溶液14天；治療組以卡泊三醇誘導(dǎo)AD模型同時(shí)，每天予兩次涂抹富含LA-Cer的保濕劑于鼠耳；對(duì)照組鼠耳每天一次涂抹20 μL無水乙醇14天。

1.4 RT-PCR 采用Trizol和promega總RNA抽提試劑盒提取鼠耳皮膚組織總RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)獲得cDNA后，采用SYBR為熒光標(biāo)記物的RT-PCR檢測(cè)皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10等的表達(dá)。結(jié)果表示為相對(duì)管家基因互達(dá)量(2-△ct)，其中ct為循環(huán)值。引物序列參考β-actin-F:TGTCCACCTTCCAGCAGATGT,β-actin-R: AGCTCAGTAACAGT-CCGCCTAG; TSLP-F GCAAATCGAGGACTGTGAG-AGC, TSLP-R: TGAGGGCTTCTCTTGTTCTCCG; IL-4-F: ATCATCGGCATTTTGAACGAGGTC, IL-4-R: ACCTTGGAAGCCCTACAGACGA; IL-33-F: CTACTGCATGAGACTCCGTTCTG, IL-33-R: AGAATCCCGTGGATAGGCAGAG; IL-10-F: TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA, IL-10-R: TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA; IL-1β-F: TGGACCTTCCAGGATGAGGACA, IL-1β-R: GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG; IFNγ-F: CAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGG, IFNγ-R: TTTCCGCTTCCTGAGGCTGGAT; FLG-F: ACAGGTGGTCATGGCAGAAGCT, FLG-R: CTCCATCTCAGATACCAGGTCC.由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graph Prism version 7.0 統(tǒng)計(jì)分析，表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間采用非成對(duì)t檢驗(yàn)(Unpaired t test)比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 富含LA-Cer的保濕劑對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)AD表型的影響 卡泊三醇涂抹鼠耳后出現(xiàn)紅腫脫屑，造模成功。與疾病組比較，治療組紅腫脫屑明顯減輕(圖1a)。治療組病理HE染色切片顯示表皮厚度較疾病組明顯減輕，與對(duì)照組比較無差異(圖1b)。疾病組鼠耳厚度(0.510±0.035)cm較對(duì)照組(0.197±0.009)cm均增加，治療組(0.375±0.015)cm較疾病組明顯變薄(P<0.0001)，與對(duì)照組比較仍增厚(圖1c)。在第7天已經(jīng)出現(xiàn)三組鼠耳厚度差異，第14天三組鼠耳厚度差異更加明顯(圖1d)。

2.2 富含LA-Cer的保濕劑對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)的AD樣皮損相關(guān)炎癥因子的影響 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)對(duì)照組，疾病組，治療組鼠耳皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β，IL-33，IFNγ的表達(dá)。與對(duì)照組比較，疾病組皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β， IFNγ表達(dá)均增高(P<0.05)，IL-33有升高趨勢(shì) 。與疾病組比較，治療組皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-1β表達(dá)降低，TSLP，IL-1β表達(dá)的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而調(diào)節(jié)性的細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)在疾病組和治療組未見明顯差異(圖2)。

2.3 富含LA-Cer的保濕劑對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)的AD皮膚屏障的影響 疾病組皮損內(nèi)FLG表達(dá)較對(duì)照組降低，治療組與疾病組比較FLG表達(dá)升高(P=0.1359)(圖3a)。疾病組鼠耳皮膚含水量(6.750±1.258)au明顯低于對(duì)照組(39.250±6.130)au(P<0.0001)。與疾病組比較，治療組皮膚含水量(22.500±2.081)au恢復(fù)(P<0.0001)(圖3b)。

1a：皮損嚴(yán)重程度；1b：鼠耳組織病理(HE,×100)；1c：鼠耳厚度變化；1d：第7、14天鼠耳厚度比較。數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)，***P<0.001 ****P<0.0001

圖1 保濕劑對(duì)AD樣皮損表型的影響

2a：TSLP表達(dá)；2b：IL-4表達(dá)，IFNr表達(dá)；2c：IL-1β表達(dá)，IL-33表達(dá)，IL-10表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 保濕劑對(duì)AD樣皮損內(nèi)相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

3a：FLG mRNA的表達(dá)；3b：皮膚含水量的變化。數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)，*P<0.05，****P<0.0001

圖3 保濕劑對(duì)AD屏障的影響

3 討論

保濕劑應(yīng)用于輕度AD可以顯著改善皮膚水含量，減輕疾病嚴(yán)重程度，并減少AD復(fù)發(fā)的頻率和強(qiáng)度[9，12，13]，保濕劑的作用主要在于修復(fù)皮膚屏障。但部分保濕劑可能會(huì)損害皮膚屏障，引起皮膚慢性炎癥反應(yīng)[14]。該研究發(fā)現(xiàn)富含LA-Cer的保濕劑對(duì)皮膚屏障修復(fù)和炎癥控制均有益。AD皮損長鏈神經(jīng)酰胺、脂肪酸的含量均降低[21]，出現(xiàn)屏障破壞?？ú慈纪磕ㄊ蠖笃つw屏障破壞，皮膚干燥。富含LA-Cer的保濕劑明顯增加皮膚水含量，另一方面通過補(bǔ)充皮損局部缺失的神經(jīng)酰胺、亞油酸維持角質(zhì)層脂質(zhì)平衡，補(bǔ)充不飽和脂肪酸可能通過刺激PPARr增加內(nèi)源性脂質(zhì)合成[22]，調(diào)動(dòng)機(jī)體自身修復(fù)屏障。

皮損處Th1和Th2失衡，TSLP、IL-4/IL-13以及IFNγ等細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)是AD重要免疫學(xué)特征[15，16]?？ú慈甲鳛榫S生素D的衍生物與受體結(jié)合后，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌TSLP，活化Th2細(xì)胞分泌IL-4/IL-13，誘導(dǎo)原始T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化[15，17]?？ú慈即龠M(jìn)皮膚中TSLP，IL-4，IL-1β，IL-33，IL-10，IFNγ表達(dá)[18]。研究顯示外用富含LA-Cer的保濕劑降低卡泊三醇誘導(dǎo)的AD鼠模型皮膚TSLP、IL-4和IL-1β表達(dá)，外用富含LA-Cer的保濕劑具有抑制AD中Th2細(xì)胞因子的作用，還抑制炎癥共同通路的炎癥因子IL-1β。Th1型細(xì)胞因子IFNγ和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10皮損局部表達(dá)未見明顯降低，卡泊三醇誘導(dǎo)的AD鼠模型中皮損主要由Th2類細(xì)胞因子高表達(dá)導(dǎo)致，猜想外用保濕劑后，皮損嚴(yán)重程度變化趨勢(shì)最相關(guān)的是Th2類細(xì)胞因子表達(dá)變化。

TSLP、IL-4和IFNγ有抑制角質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，破壞皮膚屏障的作用。阻斷TSLP，IL-4信號(hào)通路，F(xiàn)LG的表達(dá)升高，皮膚屏障修復(fù)[19]。研究中觀察到外用富含LA-Cer的保濕劑抑制TSLP，IL-4表達(dá)，促進(jìn)FLG的表達(dá)。猜測(cè)外用富含LA-Cer的保濕劑抑制特應(yīng)性皮炎樣炎癥，促進(jìn)皮膚屏障的修復(fù),阻斷“由外至內(nèi)，再到外”的循環(huán)，該循環(huán)解釋了AD屏障相關(guān)遺傳異常在外界因素刺激下易發(fā)生下游炎癥，產(chǎn)生的Th2類細(xì)胞因子反過來破壞滲透屏障功能，加重AD的機(jī)制[20]。所以，皮膚屏障的修復(fù)隔絕外源性刺激物或者過敏源來減輕皮膚炎癥反應(yīng)，兩者形成良性循環(huán)。

絲聚蛋白(flaggrin，F(xiàn)LG)基因突變是導(dǎo)致AD患者皮膚屏障破壞的重要因素，AD患者皮損與非皮損區(qū)FLG表達(dá)均較正常人低[6，23]?？ú慈寄芤种艶LG表達(dá)，該研究結(jié)果顯示外用富含LA-Cer的保濕劑可能具有促進(jìn)FLG表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞分化，內(nèi)源性修復(fù)皮膚屏障的作用。

綜上，我們?cè)贏D鼠模型上研究富含LA-Cer的保濕劑對(duì)特應(yīng)性皮炎的影響，結(jié)果顯示外用富含LA-Cer的保濕劑阻斷炎癥和屏障破壞的惡性循環(huán)，具有抑制炎癥和修復(fù)屏障的雙重作用，從而改善特應(yīng)性皮炎的癥狀。具體通路機(jī)制仍待于進(jìn)一步探究。