孫 瑾 張俊卿 黃延林 楊芳裕 董桂江 田新華

(廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)外科,廈門361004)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，多種治療膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)方法如手術(shù)切除、放療、化療、伽瑪?shù)?，X刀等均不斷改進(jìn)，但總體治療效果仍不理想，大部分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在2年內(nèi)死亡[1-3]。細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)治療作為一種新興的治療手段，已在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中證實(shí)對(duì)肺癌、肝癌、淋巴癌等腫瘤有一定療效[4]，因此，也為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了新的方向。在這些細(xì)胞因子中,IL-12的研究目前比較全面[5]，IL-12不僅具有在一系列病理、生理變化過(guò)程中促進(jìn)TH1細(xì)胞增殖、分化、活化功能，還有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、分化的作用。人體內(nèi)IL-12可以增加機(jī)體抵抗細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等外來(lái)生物侵襲的能力，能促進(jìn)抗腫瘤免疫，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒效應(yīng)。所有功能都與其結(jié)構(gòu)及分子形態(tài)緊密相關(guān)，IL-12具有約70 kD的異二聚體細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)，兩條多肽鏈分別是40 kD(p40)和35 kD(p35)，編碼兩條鏈的基因位于兩條不同染色體，具有互不相同調(diào)節(jié)機(jī)制。p40基因存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，p35基因分布則廣泛的多，在不同類型的細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，但目前不同亞基IL-12p35的直接作用知之甚少，仍需進(jìn)一步研究探索。

CRISPR/Cas9自發(fā)現(xiàn)之后廣泛應(yīng)用在生物系統(tǒng)和疾病研究中[6]，它是一個(gè)簡(jiǎn)單并且可靠的基因組編輯工具，利用CRISPR/Cas9敲除癌細(xì)胞的特定基因，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，能夠判斷該基因?qū)δ[瘤的作用，這一方法也被用在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的研究中[7]。此次我們通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制IL-12p35在大鼠C6細(xì)胞上的DNA水平，通過(guò)相關(guān)分子細(xì)胞學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步確定IL-12p35基因敲除的大鼠C6細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖、遷移和入侵的變化，為下一步研究IL-12的功能提供方向。本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建IL-12p35基因敲除的大鼠C6穩(wěn)定細(xì)胞株，為進(jìn)一步揭示IL-12p35的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.2方法

1.2.1sgRNA靶點(diǎn)選擇及序列合成 選擇大鼠IL-12p35基因KO1、KO2、KO3 3個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及合成sgRNA：應(yīng)用http://crisprmit.edu/網(wǎng)站設(shè)計(jì)IL-12p35的sgRNA。設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下:①長(zhǎng)20 nt的寡核苷酸sgRNA核心序列按G(N)20NGG序列設(shè)計(jì)；②正義鏈模板的5′端加CACC與BbsⅠ酶切后黏性末端互補(bǔ)。sgRNA序列見(jiàn)表1。

1.2.2sgRNA表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建 Lenti-sgRNA-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建:單鏈DNA oligo兩端含酶切位點(diǎn)，經(jīng)退火處理形成雙鏈DNA，連入Lenti-sgRNA-tag 載體。酶切連接反應(yīng)體系:Vector plasmid 1 μl，Oligo雙鏈DNA 2 μl，10xBuffer Tango 2 μl，DTT 1 μl，ATP 1 μl，T7 DNA Ligase 0.5 μl，BbsI 1 μl，H2O 11.5 μl，總計(jì)20 μl。酶切連接反應(yīng)條件為:37℃ 5 min，21℃ 5 min，16℃ 30 min共6個(gè)循環(huán)，4℃保存。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DHα感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐抗性的LB平板進(jìn)行篩選，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3大鼠IL-12p35基因靶點(diǎn)病毒包裝 已經(jīng)制備Lenti-sgRNA-EGFP質(zhì)粒、對(duì)照病毒和Lenti-CAS9-puro質(zhì)粒病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因)，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集上清液。在濃縮后293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度，最終得到1株篩選Cas9穩(wěn)定細(xì)胞株并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)換 大鼠C6細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞MOI 值加適量病毒，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，通過(guò)比較熒光率來(lái)比較各組轉(zhuǎn)染效率，感染3 d后觀察GFP表達(dá)情況，若熒光率大于80%，將細(xì)胞分成兩份，分別是12孔培養(yǎng)板中用于RNA提取和6孔板中用于蛋白提取。

1.2.5PCR及TA克隆測(cè)序評(píng)估基因敲除效果 qPCR檢測(cè)Lenti-sgRNA-EGFP慢病毒感染細(xì)胞，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s；45個(gè)循環(huán)，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s；55～95℃熔解曲線分析。

TA克隆測(cè)序及Surveyor 法(錯(cuò)配酶法)檢測(cè)sgRNA 活性:有效靶點(diǎn)的PCR產(chǎn)物切膠回收后構(gòu)建T載體，藍(lán)白斑篩選，每個(gè)靶點(diǎn)隨機(jī)送測(cè)30個(gè)左右單克隆測(cè)序，軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，對(duì)比靶點(diǎn)有效突變率。KO1靶點(diǎn)共測(cè)通30個(gè):其中16個(gè)為不同程度的插入缺失，10個(gè)無(wú)插入缺失突變，3個(gè)為空載體，1個(gè)無(wú)法判定，計(jì)算KO1靶點(diǎn)的突變率達(dá)到50%以上?；旌峡寺ool檢測(cè)PCR反應(yīng)條件:50 μl PCR體系包括上、下游引物1 μl，2×Taq Plus Master Mix 25 μl，Genomic DNA 2 μl，ddH2O 22 μl，總計(jì) 50 μl。反應(yīng)條件為 95℃ 變性3 min；95℃ 變性30 s，57℃退火45 s，72℃ 延伸105 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸5 min，4℃保存。取反應(yīng)后產(chǎn)物5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。CruiserTM篩選活性sgRNA酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物3～5 μl，Detecase Buffer 2 μl，Detecase 1.5 μl，加入ddH2O至10 μl，45℃反應(yīng)20 min后立即向上述10 μl體系內(nèi)加入2 μl Stop Buffer。sgRNA靶點(diǎn)附近基因組DNA擴(kuò)增，并進(jìn)行正向測(cè)序，sgRNA位點(diǎn)后區(qū)域發(fā)現(xiàn)低矮套峰說(shuō)明基因敲除成功。

榆陽(yáng)區(qū)雖然幾十年來(lái)在生態(tài)建設(shè)、水土保持方面取得巨大成效，但整體上的生態(tài)系統(tǒng)依然是很脆弱的。因此，在搞好自身生態(tài)建設(shè)的同時(shí)，尋找一條可以讓農(nóng)民穩(wěn)定收入、持續(xù)發(fā)展的生態(tài)產(chǎn)業(yè)化道路，對(duì)整個(gè)榆林而言，具有非常重要的戰(zhàn)略意義。

表1 sgRNA寡核苷酸序列

Tab.1 Synthesized oligonucleotide sequences

PlasmidsgRNA numbersgRNA sequencesPCA00287Sg13′-CGTCCTCACCATGTCGTCCG-5′PCA00288Sg25′-TAAACCACCTCACTTCGGCC-3′PCA00289Sg35′-AAACATTACTCTTGCACTGC-3′

1.2.6Western blot驗(yàn)證靶點(diǎn)有效性 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使各組酶切后C6蛋白質(zhì)按分子量從大到小在凝膠中分離，凝膠分成條帶蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，一抗IL-12p35(1∶500)與IL-12p35蛋白雜交結(jié)合后，用酶標(biāo)的二抗Rabbit(1∶2 000)雜交結(jié)合，X光底片暴光條帶顯示IL-12p35蛋白，從而對(duì)IL-12p35蛋白表達(dá)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

1.2.7慢病毒感染C6細(xì)胞 感染前1天在6-well培養(yǎng)板培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，當(dāng)天按組別(表2)加慢病毒顆粒行C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)。3 d后熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，熒光率達(dá)80%以上，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以備后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.8MTT檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IL-12p35基因敲除細(xì)胞用胰酶消化后，接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞培養(yǎng)至1、2、3、4、5 d后進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，按照MTT試劑盒使用說(shuō)明處理待檢細(xì)胞，培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出，測(cè)量490 nm處OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)并繪制曲線。

1.2.9PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè) 胰酶消化各實(shí)驗(yàn)組，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，5 ml離心管收集細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。1 300 r/min離心5 min，4℃的D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀1次。1 300 r/min離心5 min，4℃預(yù)冷75%乙醇固定。1 300 r/min離心5 min 去固定液，D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀一次。配制細(xì)胞染色液，流式檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析。

表2 細(xì)胞感染分組

Tab.2 Cell infection experiment group and virus dosage

SequenceNameGroupTiter(U/ml)Dosage(μl)PCA00287LV-Il12a-SgRNAKO1×1094.00PCA00024SgRNA-CON244NC1×1094.00

2 結(jié)果

2.1重組表達(dá)載體Leti-CAS9-puro載體的構(gòu)建與鑒定 Leti-CAS9載體示意圖及sgRNA插入位置如圖1所示。正確連接的重組載體測(cè)序結(jié)果表明，203～224位堿基是sgRNA插入序列，見(jiàn)圖1。

2.2sgRNA慢病毒感染細(xì)胞3個(gè)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)染效率的比較 KO1、KO2和KO3熒光率均大于80%，CON、PC組均小于20%，見(jiàn)圖2。

2.3PCR檢測(cè)酶切前后IL-12p35基因表達(dá)水平的比較 KO1、KO2均相對(duì)于NC表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖3。

圖1 Leti-CAS9載體示意圖以及小向?qū)Ч押塑账岵迦胛稽c(diǎn)Fig.1 Schematic diagram of Leti-CAS9 vector and small guide oligonucleotide insertion site

圖2 IL-12p35基因KO1，KO2和KO3 3個(gè)靶點(diǎn)sgRNA慢病毒感染細(xì)胞比較Fig.2 Comparison of sgRNA lentivirus infection cells from three targets of IL-12p35 gene KO1,KO2 and KO3

圖3 Pool PCR檢測(cè)酶切前后比較Fig.3 Pool PCR comparation before and after enzymecuttingNote: A.PCR(pre enzyme digestion)；B.Cruiser(after enzyme digestion).

圖4 TA克隆測(cè)序及Surveyor法Fig.4 TA clone sequencing and SurveyorNote: A.Sg1 sequence；B.Sg1.Targeting knockout sequence.

圖5 Western blot檢測(cè)C6細(xì)胞，三個(gè)靶點(diǎn)及對(duì)照組的結(jié)果Fig.5 Results of C6 cells,3 targets and control group were detected by Western blot

2.4TA克隆測(cè)序及Surveyor法驗(yàn)證基因敲除 sgRNA位點(diǎn)后區(qū)域發(fā)現(xiàn)低矮套峰說(shuō)明基因敲除成功，見(jiàn)圖4A、B。

2.5Western blot檢測(cè) 由結(jié)果可以看出，KO1和KO2兩個(gè)靶點(diǎn)均檢測(cè)出活性。在C6細(xì)胞中檢測(cè)到目的條帶，KO1、KO2和KO3均相對(duì)于NC表達(dá)下調(diào)(圖5)。

2.6MTT檢測(cè) KO組細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)，細(xì)胞增殖倍數(shù)小于NC組(P<0.05)，而培養(yǎng)1～4 d時(shí)無(wú)明顯差別(圖6)。

2.7細(xì)胞周期檢測(cè) KO組細(xì)胞處于G1、G2/M期的比例為70.36%，高于NC組的65.20%(P<0.05)(圖7)。

圖6 各組細(xì)胞培養(yǎng)1～5 d時(shí)增殖倍數(shù)的比較Fig.6 Comparison of cell proliferation multiple in each group at 1-5 daysNote: KO group NC group at fifth day,*.P<0.05.

圖7 PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of PI-FACS cell cycle detection

3 討論

基因敲除是通過(guò)插入突變及基因靶向技術(shù)應(yīng)用同源重組原理使目的基因喪失功能，CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用與同源sgRNA目的基因特異結(jié)合基因組DNA形成雜合雙鏈，Cas9這個(gè)特定核酸內(nèi)切酶對(duì)這條雜合雙鏈切割并引起DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)產(chǎn)生位點(diǎn)特異性核酸酶，通過(guò)錯(cuò)誤傾向非同源末端連接修復(fù)切斷雙鏈，這樣修復(fù)功能將使斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生插入或缺失。CRISPR/Cas9具備快速可靠、特異性及敲除效率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。

我們?cè)谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建由CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割而產(chǎn)生Lenti-sgRNA-EGFP質(zhì)粒的Cas9核酸內(nèi)切酶基因，并將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，得到可表達(dá)細(xì)胞的特定核酸內(nèi)切酶。通過(guò)SURVEYOR分析試劑盒我們進(jìn)行產(chǎn)物多態(tài)性分析和特定位點(diǎn)的切割效率檢測(cè)，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的基因測(cè)序、PCR及Western blot均證實(shí)IL-12p35基因敲除成功。MTT通過(guò)檢測(cè)sgRNA病毒感染的細(xì)胞組活力來(lái)驗(yàn)證IL-12p35基因?qū)?xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在第5天細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯增加，說(shuō)明IL-12p35基因在細(xì)胞增殖特定時(shí)期對(duì)C6產(chǎn)生重大影響，與既往黑色素瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[8]。

正常細(xì)胞周期是所有細(xì)胞生存基本條件，若細(xì)胞周期紊亂將引起細(xì)胞相關(guān)功能調(diào)節(jié)混亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至癌變。細(xì)胞會(huì)主動(dòng)激活不同地方檢查點(diǎn)應(yīng)對(duì)DNA損傷，確認(rèn)基因組完整性及細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)[9]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)成功篩選出了IL-12p35敲除細(xì)胞株，流式細(xì)胞檢測(cè)PI 熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞各時(shí)相的DNA分布狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-12p35敲除細(xì)胞株的細(xì)胞周期進(jìn)程明顯減慢，說(shuō)明IL-12p35在G2/M期的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。

p35亞基在IL-12種屬特性中起決定性作用，IL-12基因修飾腫瘤細(xì)胞疫苗用于腦膠質(zhì)瘤治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，很可能取得令人鼓舞的效果，特別是IL-12對(duì)抗惡性膠質(zhì)瘤分泌免疫抑制因子，如TGF-β、PGE-2、IL-10、胰島素樣生長(zhǎng)因子[10]，提高膠質(zhì)瘤抗原的表達(dá)，激活CTL、NK特異和非特異免疫殺傷細(xì)胞活性。本研究構(gòu)建IL-12p35基因的CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，將為后續(xù)構(gòu)建IL-12敲除干細(xì)胞和敲除小鼠提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。