潘光敏，申婷婷，陳寧，季萬勝，高志星，代洪生，王津迪

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濰坊 261031）

胃癌是我國常見的高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤之一，且在消化道惡性腫瘤中居首位[1]。胃癌高死亡率一個很重要的原因是早期發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物很少，早期診斷率低。低氧是惡性腫瘤生長的微環(huán)境特征之一。Δ133p53和p53β是p53選擇性表達(dá)的2種常見異構(gòu)體，兩者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。目前，有關(guān)p53異構(gòu)體在低氧環(huán)境中的報道較少。本實驗利用二氯化鈷CoCl2模擬腫瘤低氧微環(huán)境[3]，觀察低氧對胃癌細(xì)胞生長、遷移的影響，以及p53異構(gòu)體表達(dá)變化。探討p53異構(gòu)體在缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用及分子機制，為篩選胃癌精細(xì)治療的靶分子，以及為臨床早期診斷和治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胃癌細(xì)胞株SGC7901由第四軍醫(yī)大學(xué)饋贈，二氧化鈷CoCl2（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），CCK-8（上海翊圣生物科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶及青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司），Trizol試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（日本東洋紡株式會社），巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（nested reverse transcription-polymerase chain reaction, nRTPCR）擴增試劑（Pre-mix Taq）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），瓊脂糖（上海YIto企業(yè)有限公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 u/ml青鏈霉素）中，置于5%二氧化碳CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中。每48 h更換1次新鮮培養(yǎng)基，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。48～72 h后用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度的CoCl2處理后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到96孔板中（100μl/孔，密度約為5×104個/ml）。以“十”字水平輕搖培養(yǎng)板，使細(xì)胞平鋪其中，并注明接種時間、細(xì)胞名稱等。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)液，加入同體積含以下不同藥物濃度的完全培養(yǎng)液?？瞻捉M：不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液。對照組：含細(xì)胞和不含藥物的培養(yǎng)液。實驗組：①25μmol/L CoCl2組；②50μmol/L CoCl2組；③100μmol/L CoCl2組。每組設(shè)3個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液加入100μl體積分?jǐn)?shù)為10% CCK-8的新鮮完全培養(yǎng)液（避光操作），培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀（波長450 nm）測各孔吸光度值。取每組平均值計算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力 =（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1 α, HIF-1α）mRNA的表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞，均勻接種到6孔板中（密度約2×104～3×104個/ml）。過夜細(xì)胞貼壁后，每孔加入含CoCl2的培養(yǎng)基2 ml（濃度分別為25、50及100μmol/L）。培養(yǎng)24 h后按Trizol試劑盒說明書步驟提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為20μl，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。用PRISM 7500 qRT-PCR儀（美國ABI公司）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時定量分析。引物序列及片段長度見表1。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.4 nRT-PCR檢測p53β、Δ133p53α、Δ133p53β及Δ133p53γ mRNA的表達(dá)同1.2.3方法干預(yù)細(xì)胞提取總RNA進(jìn)一步合成cDNA，β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為25μl，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸2 min進(jìn)行PCR第1次擴增。擴增完后從上述反應(yīng)產(chǎn)物中取出2μl，再次加入PCR管中重新配成25μl的反應(yīng)體系。按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR第2次擴增：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸2 min，第2次所得產(chǎn)物即為最終產(chǎn)物。配置2%瓊脂糖凝膠100 V電壓電泳25 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。引物序列及片段長度見表1。

1.2.5 劃痕愈合實驗檢測胃癌細(xì)胞的遷移能力實驗前將6孔板、直尺及槍頭照射紫外線30 min，6孔板背面用直尺比著均勻地劃橫線，每孔穿過≥5條線。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到6孔板中（每孔約為2.1×105個細(xì)胞）。過夜細(xì)胞貼壁后，用白槍頭比著直尺自上而下劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。磷酸鹽緩沖液洗滌2次，去除劃下的細(xì)胞，加入含1%血清的完全培養(yǎng)基及藥物。實驗分組為對照組和100μmol/L CoCl2組。置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中，按0、6、12及24 h取樣拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2對人胃癌細(xì)胞活力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示25、50及100μmol/L CoCl2作用人胃癌細(xì)胞后，其細(xì)胞活力分別為（104.28±4.48）%、（111.59±6.99）% 及（130.33±8.58）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.404，P=0.009），細(xì)胞活力在100μmol/L內(nèi)隨濃度升高而增強。說明CoCl2模擬的低氧微環(huán)境中細(xì)胞生長并未受到抑制，一定程度的低氧條件可促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長。

2.2 CoCl2對人胃癌細(xì)胞HIF-1α、p53β、Δ133p53α、Δ133p53β及Δ133p53γ mRNA表達(dá)的影響

在人胃癌細(xì)胞中，不同濃度CoCl2對人胃癌細(xì)胞HIF-1α、p53β、Δ133p53α 及 Δ133p53β mRNA的相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，25μmol/L和50μmol/L CoCl2組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100μmol/L CoCl2組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），100μmol/L CoCl2組 HIF-1α、Δ133p53α及Δ133p53β的表達(dá)量高于對照組，而p53β的表達(dá)量低于對照組。對照組與實驗組未檢測到Δ133p53γ的表達(dá)。見表2和圖1、2。

2.3 CoCl2對人胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗顯示，用100μmol/L CoCL2處理人胃癌細(xì)胞24 h后，其向空隙處遷移的距離大于對照組細(xì)胞。結(jié)果表明，缺氧后胃癌細(xì)胞的遷移速度加快。見圖3。

表2 各組人胃癌細(xì)胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相對表達(dá)量比較 （n =3，±s）

表2 各組人胃癌細(xì)胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相對表達(dá)量比較 （n =3，±s）

p53β mRNA對照組 1.00±0.00 1.47±0.03 1.27±0.05 1.33±0.02 25μmol/L CoCl2組 1.19±0.16 1.56±0.03 1.39±0.04 1.27±0.04 50μmol/L CoCl2組 1.30±0.20 1.55±0.04 1.38±0.11 1.47±0.04 100μmol/L CoCl2組 1.91±0.29 1.61±0.04 1.50±0.04 1.25±0.03 F值 12.326 6.831 6.589 26.025 P值 0.002 0.013 0.015 0.000組別 HIF-1α mRNA Δ133p53α mRNA Δ133p53β mRNA

圖1 各組人胃癌細(xì)胞中Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ及p53β mRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 各組人胃癌細(xì)胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

圖3 不同時間點劃痕愈合實驗結(jié)果 （×40）

3 討論

低氧是惡性腫瘤生長的微環(huán)境特征之一，腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的一個重要變化就是HIF-1α的激活。ROHWER等[4]發(fā)現(xiàn)，約90%的晚期胃癌標(biāo)本表達(dá)HIF-1α。GRIFFITHS等[5]進(jìn)一步證實，在正常胃黏膜活檢組織中未檢測到HIF-1α的表達(dá)。另有研究表明，HIF-1α在具有侵襲性特征的胃癌中高表達(dá)，在復(fù)發(fā)胃癌中尤為明顯[6]。胃癌中HIF-1α可通過上調(diào)其下游基因血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子而誘導(dǎo)胃癌血管生成，并參與腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。而干擾HIF-1α后，胃癌細(xì)胞的增殖水平降低[8]，體外敲除HIF-1α可減少胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及黏附[4]。綜上可推測，HIF-1α在胃癌細(xì)胞遷移、侵襲中發(fā)揮重要作用，可能在疾病的晚期更為明顯。

傳統(tǒng)上認(rèn)為，抑癌基因TP53可預(yù)防腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，但其突變狀態(tài)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。p53可通過雙重啟動選擇性表達(dá)12種剪接異構(gòu)體，如p53、p53β、p53γ、Δ40p53、Δ40p53β、Δ40p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ160p53、Δ160p53β及Δ160p53γ[9]。研究證實，p53異構(gòu)體在胃癌[2]、結(jié)腸癌[10-11]、膽管癌[12]、乳腺癌[13]及神經(jīng)母細(xì)胞瘤[14]等有異型表達(dá)。

Δ133p53和p53β是p53選擇性表達(dá)的2種常見異構(gòu)體。WEI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌感染可利用其Ⅳ型分泌系統(tǒng)通過CAG致病島活化激活蛋白1，進(jìn)而特異性地激活TP53P2啟動子，引起Δ133p53的表達(dá)，使幽門螺旋桿菌相關(guān)慢性胃炎向胃癌進(jìn)展。結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中Δ133p53表達(dá)升高，p53β表達(dá)降低。p53β與全長p53協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞衰老，而Δ133p53可延長細(xì)胞復(fù)制壽命[11]，這與在胃癌化療中的研究結(jié)果一致[2]。該實驗的前期研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中Δ133p53與癌基因鼠雙微體基因2（mousedouble minute 2, MDM2）呈正相關(guān)，而與抑癌基因磷酸酶張力蛋白同源基因呈負(fù)相關(guān)[16]，促使具有E3連接酶活性的MDM2通過蛋白酶體機制促進(jìn)p53泛素化進(jìn)而降解，使p53功能失活。因此，Δ133p53異構(gòu)體可發(fā)揮促癌作用，p53β協(xié)同p53發(fā)揮抑癌作用。進(jìn)一步了解胃癌p53的狀態(tài)非常必要。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在100μmol/L CoCl2濃度內(nèi)，隨著缺氧程度的增加，人胃癌細(xì)胞活力逐漸增強。 且 100μmol/L CoCl2組 HIF-1α、Δ133p53α及Δ133p53β mRNA相對表達(dá)量高于對照組，而p53β mRNA低于對照組。對照組與實驗組未檢測到Δ133p53γ的表達(dá)。根據(jù)以上結(jié)果推測，缺氧所誘導(dǎo)的HIF-1α可能通過某一途徑激活具有促癌作用的Δ133p53α、Δ133p53β，而不是Δ133p53γ的表達(dá)；同時抑制具有抑癌作用的p53β的表達(dá)來削弱細(xì)胞中p53的促凋亡作用，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長與遷移。

綜上所述，胃癌進(jìn)展過程中出現(xiàn)的低氧微環(huán)境可進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長、遷移。p53異構(gòu)體中的Δ133p53α、Δ133p53β 及p53β有望成為胃癌基因診斷的可能指標(biāo)。通過一定的技術(shù)手段抑制Δ133p53α、Δ133p53β的表達(dá)或激發(fā)p53β的表達(dá)，可為胃癌藥理研究提供新的思路。然而目前尚不清楚HIF-1α是如何上調(diào)Δ133p53α、Δ133p53β，以及抑制p53β的表達(dá)，還待進(jìn)一步研究。