（嘉興市第二醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 嘉興 314000）

細胞自噬是真核生物普遍存在的一種自穩(wěn)機制，在細胞自我保護、胚胎發(fā)育及生物生存等機體正常生理機制中發(fā)揮關鍵作用。自噬失調與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切[1]，近年來大量研究表明自噬參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體機制尚不明確[2-3]。JAK2/STAT3信號通路在大腸癌的增殖、凋亡及侵襲轉移等過程中均發(fā)揮重要作用[4]。本文通過研究自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路在大腸癌中的相關性，為探索大腸癌的發(fā)病機制提供新的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2015年7月-2016年12月嘉興市第二醫(yī)院腫瘤外科大腸癌患者手術切除標本93例。根據(jù)2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標準[5]，患者均經(jīng)病理學專家檢查確認。其中，男性51例，女性42例；年齡25～83歲，平均（62.18±6.39）歲；腫瘤直徑≥5 cm 59例，＜5 cm 34例；發(fā)病部位：結腸38例，直腸55例；腫瘤分化程度：高分化29例，中分化46例，低分化18例；組織類型：管狀腺癌78例，黏液腺癌15例；浸潤深度：黏膜及黏膜下層3例，肌層11例，外膜79例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移68例。大腸癌標本和癌旁組織標本取材分別在癌灶中央的非壞死區(qū)和遠離癌組織5 cm的區(qū)域，經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定24 h，采用免疫組織化學法檢測?；颊呔鶠槭状伟l(fā)現(xiàn)，患者術前未行任何放化療、靶向治療等抗腫瘤治療。

1.2 試劑

兔抗人LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3均購自美國Cell Signal Technology公司，免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測采取免疫組織化學法檢測LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3在大腸癌組織，以及癌旁組織中的表達，具體步驟如下：脫蠟水化，梯度酒精水化，3%過氧化氫H202孵育15 min，PBS沖洗3次，放入pH值6.0的拘椽酸鈉緩沖液中，在100℃高壓鍋內1 min暴露抗原，PBS沖洗3次，添加適量聚合物輔助劑孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB試劑盒顯色，充分清洗，蘇木精復染，自來水沖洗，鹽酸酒精分化1 s，自來水沖洗，氨水返藍，自來水沖洗，二甲苯處理3次，中性樹膠封片。

1.3.2 結果判定LC3、p62及p-JAK2陽性著色部位位于細胞質，在每張切片上隨機選取10個高倍視野（400倍），每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)細胞染色強度及陽性細胞比例進行結果判斷。著色強度：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；陽性細胞比例≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%計4分。將著色強度與陽性細胞比例評分乘積作為最終評分結果，≥4分為陽性表達，＜4分為陰性表達。p-STAT3陽性著色位于細胞核，以細胞核呈棕黃色為陽性標志，計算陽性細胞占腫瘤細胞百分比，將陽性細胞百分比≥50%作為高表達組，＜50%作為低表達組。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中LC3、p62的表達及其與大腸癌臨床病理特征的關系

LC3和p62主要表達于細胞質中，為黃褐色或棕褐色顆粒（見圖1），大腸癌與癌旁組織中LC3陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。不同分化程度LC3陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者LC3陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表1、2。

大腸癌與癌旁組織p62陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），大腸癌組織低于癌旁組織。不同分化程度患者p62陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高、中分化高于低分化。有無淋巴結轉移患者p62陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移低于無淋巴結轉移。LC3、p62表達情況與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無關（P＞0.05）。見 1、2。

圖1 大腸癌及其癌旁組織中自噬相關蛋白和STAT3信號通路的表達 （免疫組織化學×400）

2.2 不同組織中JAK/STAT3通路相關分子的表達及其與大腸癌臨床病理特征的關系

p-JAK2陽性表達染色主要定位于細胞漿（見圖1）。大腸癌與癌旁組織p-JAK2陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-JAK2的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關（P＞0.05）。不同分化程度患者p-JAK2陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者p-JAK2陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表1、2。

p-STAT3陽性表達染色主要定位于細胞核和細胞漿（見圖1）。大腸癌與癌旁組織中p-STAT3陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-STAT3的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關（P＞0.05）。不同分化程度p-JAK2陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者p-JAK2陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表2。

表1 大腸癌與癌旁組織的LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3陽性率比較 [n =93，例（%）]

表2 不同因素大腸癌患者LC3、p62、p-JAK2和p-STAT3陽性率比較 例（%）

續(xù)表2

2.3 自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路的相關性

大腸癌中自噬相關蛋白LC3的表達與p-JAK2、p-STAT3的表達均呈正相關（rs=0.315和0.295，P=0.001和0.003）， 而p62的表達 與p-JAK2、p-STAT3的表達均呈負相關（rs=-0.320和-0.326，均P=0.001）。見表3。

表3 LC3、p62與p-JAK2、p-STAT3蛋白表達的相關性 例

3 討論

自噬與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，其在腫瘤發(fā)展中的作用也越來越受到重視。微管相關蛋白1輕鏈3作為哺乳動物自噬體形成，以及胞漿到空泡靶向囊泡所必需的一種蛋白，常用來作為自噬體的標志性蛋白之一，微管相關蛋白1輕鏈3表達情況可在某些程度上反映自噬體數(shù)量[6]。自噬過程中，p62蛋白與待降解蛋白結合，并包裹到自噬體中，然后被特異性降解，因此p62蛋白的表達與自噬活性呈負相關。本研究結果顯示大腸癌中LC3陽性表達率明顯高于癌旁組織，而p62在大腸癌中的陽性表達率明顯低于癌旁組織，且隨著癌組織的分化程度越低，LC3陽性表達升高而p62陽性表達率降低。表明大腸癌組織中的自噬水平明顯高于癌旁組織，且自噬水平與癌組織的分化程度和淋巴結轉移有關，組織分化程度越低，自噬水平越高；且出現(xiàn)淋巴結轉移患者自噬水平明顯高于無淋巴結轉移，這與文獻報道的研究結果相一致[7]。

JAK2-STAT3信號通路在細胞增殖、生長、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要作用，是一條與多種腫瘤的形成和發(fā)展關系密切的信號通路[8-12]。有研究表明，JAK2/STAT3信號通路在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-JAK2和p-STAT3在大腸癌中的陽性表達率高于癌旁組織，且與組織分化程度與淋巴結轉移有關，p-JAK2和p-STAT3在高、中分化癌組織中的陽性表達率低于低分化癌組織，在有淋巴結轉移癌組織中的陽性表達率高于無淋巴結轉移的癌組織，表明JAK2-STAT3信號通路的高表達可能與大腸癌的惡性程度有關，這些結果與文獻報道相一致[14]。

多項研究結果表明，JAK2/STAT3信號通路與癌細胞的凋亡密切相關[15-17]。多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，敲除JAK2可誘導細胞凋亡和自噬[18-20]。因此推測，大腸癌中自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路可能存在關聯(lián)。本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中LC3的表達與p-JAK2和p-STAT3的表達均呈正相關，p62的表達與p-JAK2和p-STAT3的表達均呈負相關。提示大腸癌中自噬活性的升高與JAK2/STAT3信號通路密切相關。

綜上所述，在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路通過內在的分子機制相互協(xié)調轉化，使細胞向惡性方向發(fā)展。因此，對兩者的深入研究有利于揭示大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，為早期發(fā)現(xiàn)、治療大腸癌提供新的理論依據(jù)。后續(xù)研究需進一步擴大樣本量，以獲得更為可靠的研究數(shù)據(jù)。