甘燦云 陳海紅 楊海燕

[摘要]目的 建立膚康凝膠適宜的微生物限度檢查方法。方法 按照《中國(guó)藥典》2015年版4部通則1105、1106、1107，分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法對(duì)膚康凝膠進(jìn)行微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證，以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌的回收率為指標(biāo)，考察需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法;建立控制菌金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查方法。結(jié)果 常規(guī)平皿法需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)顯示，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收率較低，不在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)，不符合要求;培養(yǎng)基稀釋法需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)顯示，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合要求。采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)白色念珠菌和黑曲霉的平均回收率在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)，均符合要求。采用常規(guī)法供試液組和陰性組均未檢出兩種控制菌，試驗(yàn)組金黃色葡萄球菌未被檢出，銅綠假單胞菌能被檢出，存在抑菌干擾，方法不可行;采用培養(yǎng)基稀釋法試驗(yàn)組銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能被檢出，供試液組和陰性對(duì)照組兩種試驗(yàn)菌均顯示陰性，無干擾，方法可行。三批樣品驗(yàn)證結(jié)果需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均未檢出。結(jié)論 膚康凝膠可用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行微生物限度檢查。

[關(guān)鍵詞]膚康凝膠;微生物限度檢查;回收率;方法驗(yàn)證

[中圖分類號(hào)] R286? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）9（c）-0017-05

[Abstract] Objective To establish a suitable microbial limit test method for Fukang Gel. Methods According to the 4 general principles 1105， 1106， and 1107 of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition， routine method and medium dilution method were used respectively to verify the microbial limit test of Fukang Gel. The recovery rates of five test bacteria， Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were used as indicators， the total number of Aerobic bacteria， Fungi and Yeasts was investigated， and the detection methods of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were established. Results The total number of Aerobic bacteria counted by conventional plate method showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were low， which were not in the range of 0.5-2.0 stipulated in the Pharmacopoeia and did not meet the requirements. The total number of Aerobic bacteria counted by medium dilution method showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger all met the requirements. The average recoveries of Candida albicans and Aspergillus niger counted by the total number of fungi and yeasts by plate method and medium dilution method were within the range of 0.5-2.0 prescribed in the Pharmacopoeia， which met the requirements. Two kinds of control bacteria were not detected in the test solution group and negative group by routine method. Staphylococcus aureus was not detected in the test group， Pseudomonas aeruginosa could be detected， and there was interference of bacteriostasis， so the method was not feasible. Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus could be detected in the test group by medium dilution method. Both the test solution group and the negative control group showed negative， no interference， and the method was feasible. The results of three batches of samples validation showed that the total number of Aerobic bacteria， Fungi and Yeasts were in accordance with the standard， but Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were not detected. Conclusion Fukang Gel can be used for microbial limit test by medium dilution method.

[Key words] Fukang Gel; Microbial limit test; Recovery rate; Methods validation

復(fù)方苦參洗劑是我院特色中藥制劑，具有清熱解毒、燥濕止癢的功效，主治濕疹、皮膚膿皰瘡及紅痱等引起的瘙癢性、感染性皮膚病[1]，療效顯著，廣泛應(yīng)用于臨床，深受患者青睞。由皮膚科省級(jí)名中醫(yī)鄔成霖主任醫(yī)師在中醫(yī)古方“苦參湯””的基礎(chǔ)上精心組方，研制而成，膚康凝膠則是復(fù)方苦參洗劑經(jīng)工藝劑型改造制成的外用凝膠劑。藥品中的微生物污染可直接影響藥品質(zhì)量穩(wěn)定性和引發(fā)不良反應(yīng)，因此微生物限度檢查是藥品安全性研究的重要組成部分[2]，控制藥品中的微生物是確保藥品質(zhì)量、保障藥品安全的重要措施，檢查方法隨藥典的變化而更新，醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也隨之更新。從2005版《中國(guó)藥典》開始提出藥品微生物限度要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，到2015版《中國(guó)藥典》對(duì)微生物限度檢查的培養(yǎng)基適應(yīng)性、實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求、方法適應(yīng)性等方面進(jìn)行修訂，是對(duì)藥品微生物檢查重視性的極大提高，使檢驗(yàn)結(jié)果更嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，并與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌[3]。由于中藥制劑成分多樣，有些抑菌作用的成分可能影響到微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過方法適用性試驗(yàn)來確定檢驗(yàn)方法的可行性和有效性是十分有必要的[2]。本研究選取3批膚康凝膠，按2015版《中國(guó)藥典》四部通則1105、1106、1107非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查[4]，參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的凝膠劑微生物限度檢查方法[5-8]，進(jìn)行微生物限度適用性試驗(yàn)，建立可靠的檢驗(yàn)方法，保證藥品的質(zhì)量，為相關(guān)制劑的微生物限度檢查提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)藥物? 膚康凝膠30 g/支（批號(hào)：190320， 190321，190322），由杭州市中醫(yī)院制劑室提供。

1.1.2試驗(yàn)菌種? 金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，批號(hào)：CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[Bacillus Sulticis，批號(hào)：CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，批號(hào)：CMCC（B）10104]、白色念珠菌[Candida albicans，批號(hào)：CMCC（F）98001]、黑曲霉[Aspergillus niger，批號(hào)：CMCC（F）98003]，以上菌種均來自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，為第三代菌種。

1.1.3試驗(yàn)用培養(yǎng)基及試劑? 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：170711）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1802062）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1801102）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：180228）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：170103）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：170509），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：1701033），所有培養(yǎng)基適用性檢查均合格，按說明配制，廠家均為北京三藥科技開發(fā)公司。氯化鈣、0.9%無菌氯化鈉溶液（自配）。

1.1.4試驗(yàn)儀器? GR60DA型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）、DHG9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、DK-600型電熱恒溫水浴槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、HTY-761型勻漿儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）、BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海和呈儀器制造有限公司）、HSX系列霉菌培養(yǎng)箱（上海和呈儀器制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1菌液制備方法? ①取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種至10 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18 h后，將上述培養(yǎng)物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋，計(jì)數(shù)至每1 ml中含菌數(shù)為100～1000 cfu的菌懸液，備用。②取枯草芽孢桿菌接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面，35℃培養(yǎng)24 h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，用0.9%無菌氯化鈉溶液依10倍稀釋，計(jì)數(shù)至每1 ml含菌數(shù)為100～1000 cfu的菌懸液，備用。③取白色念珠菌接種至10 ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h后，將上述培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋，計(jì)數(shù)至每1 ml含菌數(shù)為100～1000 cfu的菌懸液，備用。④取黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，25℃培養(yǎng)5 d，用5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，再用無菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋，計(jì)數(shù)至每1 ml中含孢子數(shù)100～1000 cfu的孢子懸液，備用。

1.2.2供試液的制備方法? 取膚康凝膠10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80 ml，勻漿使其溶解，再加入10%無菌氯化鈣溶液10 ml，搖勻，靜置數(shù)分鐘，所得上清液為1∶10供試液，備用。

1.2.3需氧菌總數(shù)和霉菌酵母菌總數(shù)常規(guī)法計(jì)數(shù)? ①試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法具體如下。a.需氧菌總數(shù)：取5支1∶10的供試液9.9 ml，分別加入每1 ml含菌數(shù)100～1000 cfu的各試驗(yàn)菌0.1 ml，混勻。立即取含菌供試液1 ml，置于直徑90 mm的無菌平皿中，注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每種試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，于33℃倒置培養(yǎng)3 d，計(jì)菌落數(shù)。b.霉菌和酵母菌總數(shù)：取2支1∶10供試液9.9 ml，分別加入每1 ml含菌數(shù)100～1000 cfu的各試驗(yàn)菌0.1 ml，混勻。取含菌供試液1 ml，置于直徑90 mm的無菌平皿中，注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每種試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，于23℃倒置培養(yǎng)5 d，計(jì)菌落數(shù)。②供試品對(duì)照組：按試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法，以稀釋劑代替菌液，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。③菌液對(duì)照組：按試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法，采用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，測(cè)定菌數(shù)。

1.2.4需氧菌總數(shù)和霉菌酵母菌總數(shù)培養(yǎng)基稀釋法計(jì)數(shù)? ①試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法具體如下。a.試驗(yàn)組需氧菌總數(shù)：取5支1∶10的供試液9.9 ml，分別加入每1 ml含菌數(shù)100～1000 cfu的各試驗(yàn)菌0.1 ml，混勻。立即取含菌供試液1 ml，置于直徑90 mm的無菌平皿中，每皿0.2 ml，注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，于33℃倒置培養(yǎng)3 d，計(jì)菌落數(shù)。b.霉菌和酵母菌總數(shù)：取2支1∶10供試液9.9 ml，分別加入每1 ml含菌數(shù)100～1000 cfu的各試驗(yàn)菌0.1 ml，混勻。取含菌供試液1 ml，置于直徑90 mm的無菌平皿中，每皿0.2 ml，注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于23℃倒置培養(yǎng)5 d，計(jì)菌落數(shù)。②供試品對(duì)照組按試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法，以稀釋劑代替菌液，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。③菌液對(duì)照組按試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，測(cè)定菌數(shù)。

1.2.5回收率計(jì)算方法? 各菌株回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)﹣供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)?；厥章试谒幍湟?guī)定0.5～2.0范圍內(nèi)，提示該方法可用于供試品需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)檢查，若有試驗(yàn)菌回收率不在規(guī)定范圍內(nèi)，則需進(jìn)一步用適宜的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)常規(guī)法? ①試驗(yàn)組控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)具體如下。a.金黃色葡萄球菌檢查：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入1 ml含10～100 cfu金黃色葡萄球菌，33℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。b.銅綠假單胞菌檢查：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。②供試品溶液組取1∶10供試液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗(yàn)組，觀察培養(yǎng)結(jié)果。③陽(yáng)性對(duì)照組取相應(yīng)菌液各1 ml，分別接種于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，檢查方法同試驗(yàn)組。④陰性對(duì)照組取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液10 ml直接加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗(yàn)組，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.7控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋法? ①試驗(yàn)組控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)具體如下。a.金黃色葡萄球菌檢查：取1∶10供試液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入1 ml含10～100 cfu金黃色葡萄球菌，33℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。b.銅綠假單胞菌檢查：取1∶10供試液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。②供試品溶液組取1∶10供試液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗(yàn)組，觀察培養(yǎng)結(jié)果。③陽(yáng)性對(duì)照組取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液10 ml，各菌液1 ml，分別接種于200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，檢查方法同試驗(yàn)組。④陰性對(duì)照組取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液10 ml直接加至200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗(yàn)組，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.8三批凝膠微生物限度檢查? 根據(jù)2015版藥典制劑通則凝膠劑的質(zhì)量要求及非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法，需氧菌總數(shù)限度為102 cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)限度為10 cfu/g，每1 g樣品中不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

2結(jié)果

2.1計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的平均回收率? 常規(guī)平皿法需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)顯示，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收率較低，不在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)，不符合要求;培養(yǎng)基稀釋法需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)顯示，5種試驗(yàn)菌回收率均符合要求（表1）。

2.1.2霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的平均回收率? 采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)白色念珠菌和黑曲霉的平均回收率在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)，均符合要求（表2）。

2.2控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

采用常規(guī)法供試液組和陰性組均未檢出兩種控制菌，試驗(yàn)組金黃色葡萄球菌未被檢出，銅綠假單胞菌能被檢出，存在抑菌干擾，方法不可行（表3）;采用培養(yǎng)基稀釋法試驗(yàn)組銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能被檢出，供試液組和陰性對(duì)照組兩種試驗(yàn)菌均顯示陰性，無干擾，方法可行（表4）。

2.3三批凝膠微生物限度檢查結(jié)果

需氧菌總數(shù)和霉菌酵母菌總數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，控制菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞球菌均未檢出（表5）。

3討論

醫(yī)院制劑的可持續(xù)發(fā)展受制劑產(chǎn)品質(zhì)量的制約，并與臨床療效和用藥安全關(guān)系密切[9]?？刂漆t(yī)院制劑微生物限度是確保醫(yī)院制劑質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際接軌，檢查方法不斷完善和提高，微生物限度適用性試驗(yàn)為藥品微生物檢驗(yàn)提供了適宜的參考依據(jù)和科學(xué)可行的標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)采用的方法在無抑菌作用下保證供試品中含有的微生物能被檢出，從而提高中藥制劑使用的安全性和有效性[10]。

中藥制劑中所含的成分和不同的濃度對(duì)微生物有一定的抑制和殺滅作用，膚康凝膠是一種主要成分為苦參堿、黃芩苷、小檗堿等抑菌成分的外用制劑，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷等對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌作用[11]，可能會(huì)出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的假陰性，影響該制劑微生物限度檢查的準(zhǔn)確性。因此，要確定該制劑的檢驗(yàn)方法，提高污染微生物的檢出率，需采用適宜的方法消除自身抑菌作用的干擾，進(jìn)行微生物適用性試驗(yàn)[12-13]。微生物適用性試驗(yàn)開展的一般策略為先平皿法[14]，后薄膜過濾法，從最低稀釋級(jí)開始，選擇適宜的稀釋級(jí)。與2010版《中國(guó)藥典》相比采用驗(yàn)證的試驗(yàn)菌有所不同，為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌，菌液在供試品溶液制備過程中就直接加入混勻，所加菌液不超過供試液的1%[15]，加菌時(shí)機(jī)提前，更能模擬樣品污染狀態(tài)，更真實(shí)地反映樣品的染菌情況[16]。如藥品有抑菌活性，消除樣品抑菌性的主要技術(shù)手段為增大稀釋液或培養(yǎng)基稀釋法、加入中和劑或滅活劑、薄膜過濾法或上述幾種方法的聯(lián)合使用[17-18]。若藥物成分抑菌作用較弱，采用培養(yǎng)基稀釋法可符合試驗(yàn)要求[19];薄膜過濾法雖可直接過濾抑菌成分，但不適用于非完全溶解的供試品。本試驗(yàn)藥品為中藥凝膠，加入稀釋液后并未完全溶解，需加入氯化鈣溶液破膠，取上清液作為供試品，上清液看似溶液狀態(tài)但含細(xì)小的不溶性藥物，會(huì)堵塞濾膜[20]，2015版藥典供試品處理已取消離心法，故采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，采用常規(guī)平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收率較低，且顯著<0.5，控制菌檢查試驗(yàn)組中的金黃色葡萄球菌未被檢出，可能與其中抑菌性成分的作用有關(guān)，因此常規(guī)法無法準(zhǔn)確檢出藥品是否被污染，不符合要求;采用培養(yǎng)基稀釋法，各試驗(yàn)菌的回收率相比常規(guī)法都有提高，且回收率均>0.7，在藥典規(guī)定的最短時(shí)間內(nèi)，控制菌均能被檢出，可消除膚康凝膠的抑菌活性，符合藥典規(guī)定。

本試驗(yàn)對(duì)膚康凝膠進(jìn)行微生物限度方法適用性研究，最終確定該凝膠的檢查方法為：取10 g膚康凝膠，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80 ml，勻漿使其溶解，再加入10%無菌氯化鈣溶液10 ml，搖勻，靜置數(shù)分鐘，所得上清液為1∶10的供試液。需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)取1∶10供試液1 ml，采用培養(yǎng)基稀釋法檢查，每培養(yǎng)皿0.2 ml。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查，取1∶10供試液10 ml，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基用量均為200 ml，方法可靠，適合作為膚康凝膠微生物限度檢查方法。

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（收稿日期：2019-07-11? 本文編輯：劉克明）