唐偉健，付蕓

（長春理工大學(xué) 光電工程學(xué)院，長春 130022）

隨著觀測技術(shù)的不斷發(fā)展，單細(xì)胞水平的研究逐漸成為新的熱點(diǎn)。細(xì)胞生物學(xué)通過觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)和相互作用過程，揭示細(xì)胞生命活動(dòng)的基本規(guī)律。因此，當(dāng)研究一個(gè)生物系統(tǒng)時(shí)，可以通過觀察單個(gè)細(xì)胞的生長與分化等生命過程，深入了解生物機(jī)體的結(jié)構(gòu)。如果能夠在分子水平上觀察生物現(xiàn)象，將有助于更好地理解細(xì)胞表型細(xì)微的差異是如何誘導(dǎo)生物現(xiàn)象的，如學(xué)習(xí)和記憶，或細(xì)胞的特異性變化是如何導(dǎo)致功能障礙和誘發(fā)疾病的，例如癌癥［1］。因此，對(duì)于細(xì)胞觀測方法的研究，包括實(shí)現(xiàn)其三維可視化建模可以幫助理解癌癥的形成機(jī)理，對(duì)分子動(dòng)力學(xué)、生物仿生學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和遺傳學(xué)的研究也具有重要意義。

本文采用共聚焦顯微鏡對(duì)已注入熒光探針的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行掃描，獲取一系列軸向二維斷層圖像。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）利用激光束經(jīng)照明針孔后形成的點(diǎn)光源逐點(diǎn)掃描焦平面上的樣本，樣本上的被照射點(diǎn)經(jīng)探測針孔后，成像在光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）上，并通過計(jì)算機(jī)屏幕輸出熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對(duì)于物鏡焦平面呈共軛關(guān)系，也就是說焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和探測針孔處，而焦平面以外的點(diǎn)則無法通過探測針孔成像在探測器上，經(jīng)過逐點(diǎn)掃描就得到樣本上一個(gè)斷層圖像，再通過沿著軸向移動(dòng)焦平面獲得一組二維熒光斷層圖像。本文將數(shù)字圖像處理技術(shù)，包括圖像去噪、圖像分割，以及三維重建等應(yīng)用到細(xì)胞的熒光圖像處理中，實(shí)現(xiàn)二維斷層圖像的三維可視化建模，從而更加直觀地觀測細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1 圖像預(yù)處理

在共聚焦顯微光學(xué)成像過程中，由于成像系統(tǒng)本身、光子轉(zhuǎn)換過程、熒光組織結(jié)構(gòu)和人為誤差等因素的影響，采集的圖像中必然包含噪聲，特別是當(dāng)利用強(qiáng)激發(fā)光進(jìn)行厚組織斷層成像時(shí)尤為明顯，所以必須對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理。

圖像預(yù)處理是指在圖像分割之前對(duì)細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行降噪與增強(qiáng)的過程。通過預(yù)處理可以提高二維熒光斷層圖像的質(zhì)量，增強(qiáng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的局部與整體結(jié)構(gòu)特征，改善細(xì)胞三維可視化的效果。本文采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的降噪方法進(jìn)行細(xì)胞熒光圖像的預(yù)處理。

1.1 激光共聚焦顯微鏡圖像采集

激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯FV-1000）最大分辨率4 096×4 096，每個(gè)通道4 096個(gè)灰度級(jí)（12-bit），配有 405 nm、458 nm、488 nm、515 nm、559 nm、623 nm的激光器，本實(shí)驗(yàn)選用405 nm氬離子和623 nm紅色氦氖激光器，分別用于激發(fā)細(xì)胞核和細(xì)胞膜探針，讀取細(xì)胞二維斷層圖像，通過沿Z軸移動(dòng)焦點(diǎn)得到細(xì)胞的一系列二維斷層圖像。圖1為共聚焦采集的一組二維斷層圖像。

圖1 肝癌細(xì)胞熒光二維斷層28層部分圖像

1.2 數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)去噪算法

作為計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)的一個(gè)研究方向，數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)是基于集合理論和晶格理論的組合圖像處理方法，用具有一定形態(tài)的結(jié)構(gòu)元去度量和提取圖像中的對(duì)應(yīng)形狀，以達(dá)到圖像分析和識(shí)別的目的。形態(tài)學(xué)在處理復(fù)合運(yùn)算時(shí)具有顯著的優(yōu)勢，因而常用于圖像處理中［2］。其優(yōu)勢在于采用并行處理算法，既能保留圖像中原有信息又能有效地濾除噪聲，與基于微分運(yùn)算的邊緣提取算法相比，基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)提取的邊緣信息平滑、圖像骨架連續(xù)，且斷點(diǎn)少。

數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)包括腐蝕和膨脹兩個(gè)基本運(yùn)算。腐蝕用結(jié)構(gòu)元與目標(biāo)圖像進(jìn)行邏輯運(yùn)算，可以消除二值圖像中不相關(guān)的細(xì)節(jié)。腐蝕使圖像的邊界收縮，導(dǎo)致目標(biāo)區(qū)域范圍縮小，而區(qū)域內(nèi)的孔洞變大。運(yùn)算公式可表示為：

膨脹會(huì)擴(kuò)大前景圖像的邊界，使得圖像區(qū)域擴(kuò)大，而區(qū)域內(nèi)的孔洞變小。運(yùn)算的表達(dá)式為：

腐蝕與膨脹具有不同的處理目的。腐蝕運(yùn)算可以消除圖像中無意義的小物體。膨脹運(yùn)算主要是為了彌補(bǔ)目標(biāo)圖像中的小空洞，因而具有去除內(nèi)部噪聲的作用。這兩種算法通過結(jié)合形成開運(yùn)算和閉運(yùn)算。開運(yùn)算是先腐蝕再膨脹，主要功能是對(duì)內(nèi)邊界點(diǎn)進(jìn)行平滑處理，并保持圖像邊緣形狀和位置不發(fā)生變化，其表達(dá)式為：

閉運(yùn)算是膨脹之后再進(jìn)行腐蝕，主要目的是對(duì)目標(biāo)圖像的細(xì)小空洞、外部邊緣毛刺及小橋噪聲點(diǎn)進(jìn)行彌補(bǔ)，可表示為：

開運(yùn)算和閉運(yùn)算的用途不同。開運(yùn)算處理外部細(xì)節(jié)對(duì)圖像所產(chǎn)生的影響，而閉運(yùn)算處理內(nèi)部細(xì)節(jié)對(duì)圖像的影響［3］。腐蝕運(yùn)算可以消除一些小的空洞，膨脹運(yùn)算通過邊緣擴(kuò)展來消除邊緣毛刺。通過對(duì)細(xì)胞圖像的研究和對(duì)形態(tài)學(xué)四種運(yùn)算的不同組合進(jìn)行濾波，發(fā)現(xiàn)通過對(duì)閉運(yùn)算、膨脹組合運(yùn)算和腐蝕、開運(yùn)算組合進(jìn)行串聯(lián)組合運(yùn)行能夠得到較好的去噪結(jié)果，線性組合得到組合濾波器的表達(dá)式如下［4］：

下圖為采用形態(tài)學(xué)算法的不同組合模式進(jìn)行圖像去噪的效果對(duì)比。

圖2 形態(tài)學(xué)組合濾波器的處理效果對(duì)比圖

從圖2中看出，使用開運(yùn)算和腐蝕結(jié)合形成的濾波器，不僅可以抑制毛刺和小橋噪聲點(diǎn)，而且能夠保護(hù)細(xì)胞邊緣信息。通過閉運(yùn)算和膨脹的組合運(yùn)算能夠抑制小孔噪聲和小縫噪聲，獲得平滑的細(xì)胞外邊緣信息［5］。還對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的小空洞進(jìn)行彌補(bǔ)保持了完整且平滑的邊緣信息，基本消除圖像的噪聲。

2 圖像分割

在共聚焦顯微鏡采集的二維斷層圖像中，會(huì)同時(shí)出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞，甚至部分細(xì)胞黏連、重疊等復(fù)雜現(xiàn)象。因此，必須對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行圖像分割以獲取單個(gè)細(xì)胞，這是細(xì)胞三維重建的前提。由于細(xì)胞的邊緣不規(guī)則而且具有非線性特征，如果采用線性分割算法會(huì)損失一部分邊界輪廓，而且會(huì)使重構(gòu)算法更加復(fù)雜。本文運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中的分水嶺算法進(jìn)行圖像分割。

分水嶺算法是基于拓?fù)湓硌葑兌傻膱D像分割算法，拓?fù)浔砻嫔系母呙芏葏^(qū)域代表波峰，低密度代表波谷。用不同顏色的水（標(biāo)志物）分別充滿各個(gè)波谷（即局部最低點(diǎn)），隨著水面升高，來自不同波谷、具有不同顏色的水匯合到一起。這時(shí)在水匯合的地方修建水壩，以防止水的融合。持續(xù)注水與修建水壩，直至所有的波峰都處于水面之下。這些水壩就是圖像分割的結(jié)果。這種方法已經(jīng)用于血液和骨髓標(biāo)本的圖像處理中［6］。

令 M1,M2,…,MR表示圖像g(x,y)的區(qū)域最小值點(diǎn)的坐標(biāo)集合，C(Mi)表示與區(qū)域最小值Mi相關(guān)聯(lián)的分水嶺中的點(diǎn)坐標(biāo)的集合，min和max分別表示g(x,y)的最小值和最大值。令T[n]表示滿足g(s , t)＜n的坐標(biāo)集合，即：

T[n]是g(x,y)中位于平面g(x,y)=n下方的點(diǎn)坐標(biāo)的集合。

令Cn(Mi)表示集水盆地中與淹沒階段n的最小值Mi相關(guān)聯(lián)的點(diǎn)坐標(biāo)集，則Cn(Mi)可看成下式的二值圖像：

由公式（7）和（8）可知，C[n]是T[n]的子集，所以C[n -1]也為T[n]的子集，則C[n -1]中的每個(gè)連通分量都是T[n]的一個(gè)連通分量。

但是，由于細(xì)胞圖像中的特殊性，圖像邊緣會(huì)存在很多的局部極值點(diǎn)，影響分水嶺算法出現(xiàn)過度分割現(xiàn)象。首先，需要去除影響分割效果的區(qū)域極值點(diǎn)，然后將去除后的極值點(diǎn)的像素點(diǎn)在二值圖像中用“1”表示。通過對(duì)圖像中的前景和背景部分進(jìn)行標(biāo)記，分別為內(nèi)部標(biāo)記和外部標(biāo)記。并且使內(nèi)部標(biāo)記指向背景，外部標(biāo)記指向前景，通過標(biāo)記的最小值可以確保分割線可以在內(nèi)部標(biāo)記和外部標(biāo)記之間的區(qū)域，從而確保圖像分割的合理性和精準(zhǔn)性，降低了過度分割程度保持圖像邊緣完整并取得較好的效果。圖3為分水嶺算法分離出的細(xì)胞膜及細(xì)胞核。

圖3 分水嶺分割細(xì)胞核和細(xì)胞膜圖像

3 三維重建

在細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究中，主要使用共聚焦顯微鏡來觀察細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而共聚焦顯微鏡只能獲取細(xì)胞的二維圖像，無法觀測完整的三維結(jié)構(gòu)，所以三維重建將有利于更好地認(rèn)識(shí)細(xì)胞。

由于受熒光斷層圖像層間距的限制，為了提高數(shù)據(jù)分辨率，需要進(jìn)行插值處理來改善細(xì)胞的三維可視化的效果。一般而言，斷層圖像的插值方法包括基于灰度的插值方法、基于形態(tài)學(xué)的插值方法和基于小波變換的插值方法［7-8］?；谛螒B(tài)學(xué)的插值算法是通過已知的斷層圖像的形狀，直接構(gòu)造出插值圖像的輪廓［9］。由于細(xì)胞邊緣不規(guī)則，且具有非線性的特征，所以本文選用形態(tài)學(xué)插值算法。

首先，創(chuàng)建起始對(duì)象和目標(biāo)對(duì)象作為兩個(gè)相鄰的斷層圖像。然后提取各層的邊緣輪廓，創(chuàng)建插值層。兩個(gè)斷層圖像之間的插值表明兩層之間的過渡信息，插值的目的是使兩層平滑過渡。

為了比較形態(tài)學(xué)的差異，將兩個(gè)斷層圖像重疊得到一個(gè)具有形態(tài)學(xué)差異的圖像，見圖4。Ⅲ是重疊區(qū)，Ⅰ和Ⅱ分別屬于起始對(duì)象X1或目標(biāo)對(duì)象X2，這兩個(gè)區(qū)域表示斷層圖像之間的形態(tài)學(xué)差異。插值運(yùn)算時(shí)，將Ⅱ和Ⅲ之間的邊界向區(qū)域Ⅱ移動(dòng)，從而使區(qū)域Ⅲ擴(kuò)大。同樣地，區(qū)域Ⅰ收縮直至最后消失。

為了簡化運(yùn)算，如圖4，將結(jié)構(gòu)元B的中心移動(dòng)到x′。B0是在X1外法線方向一側(cè)，Bi在內(nèi)法線方向一側(cè)。為了計(jì)算每一個(gè)插值，用Xn+1代替X2表示目標(biāo)層，則在起始對(duì)象X1和目標(biāo)對(duì)象Xn+1之間共有n-1個(gè)插值層，即X2，X3，…，Xn的計(jì)算公式：

式中，n為層間距；為第（i-1）層的目標(biāo)輪廓；為在第（i-1）層的位置x處分別進(jìn)行膨脹與腐蝕的結(jié)構(gòu)元的大?。缓蜑樾螒B(tài)學(xué)差異向量。

圖4 算法原理圖

采用八鄰域方向鏈法跟蹤起始對(duì)象的邊緣輪廓，根據(jù)左手定則始終保持起始對(duì)象位于跟蹤過程的左側(cè)。然后，對(duì)于每個(gè)鏈單元，可以通過將單元順時(shí)針旋轉(zhuǎn)900定位外法線方向，因此，輪廓上每一點(diǎn)的外法線方向可以通過幾個(gè)鄰域鏈單元的外法線方向加權(quán)來計(jì)算［10］。

已知起始層與目標(biāo)層的間隙為0.044 μm，采用4層插值，重構(gòu)的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 實(shí)驗(yàn)輸出三維圖像

由于細(xì)胞圖像采集時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液共聚焦皿中，所以只能采集出細(xì)胞為半封閉形態(tài)，重構(gòu)結(jié)果可以看出符合細(xì)胞采集時(shí)的狀態(tài)。相對(duì)于一般的插值法而言，對(duì)斷層圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)插值三維重構(gòu)，可以使兩斷層間創(chuàng)建的插值層圖像從起始層圖像不斷接近于目標(biāo)層圖像，通過邊緣方向的變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)補(bǔ)償有效的使三維結(jié)構(gòu)邊緣平滑并且沒有明顯的層間階梯感。但是由于插值層插入有限，可能會(huì)對(duì)圖像的邊緣結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞從而細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)性還有待提高。

4 結(jié)論

目前，激光共聚焦顯微鏡是用于觀察細(xì)胞形態(tài)的主要工具，但是它僅能獲取細(xì)胞的二維斷層圖像，而無法得到三維結(jié)構(gòu)。本文運(yùn)用數(shù)字圖像處理技術(shù)對(duì)采集的二維熒光斷層圖像進(jìn)行三維重建，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維可視化。

本文通過圖像預(yù)處理、圖像分割和圖像三維重建等方法完成細(xì)胞外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。首先采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)降噪算法對(duì)細(xì)胞熒光圖像進(jìn)行降噪處理。相對(duì)于常規(guī)算法，比如中值濾波、空間濾波和小波濾波等而言，形態(tài)學(xué)方法能夠獲得更好的降噪效果，同時(shí)還能保護(hù)圖像邊緣的非線性特征，取得更好的邊緣平滑效果。本文通過對(duì)比腐蝕、膨脹、開運(yùn)算和閉運(yùn)算等幾種形態(tài)學(xué)算法的處理結(jié)果，從中找出適合細(xì)胞的熒光圖像處理的組合濾波器。其次，采用分水嶺算法進(jìn)行圖像分割。由于細(xì)胞邊緣具有非線性特征，常用的線性分割算法無法滿足需要。因此，本文采用形態(tài)學(xué)中分水嶺算法進(jìn)行圖像分割，通過構(gòu)建水壩與分離集水盆的方式提高分割效果，保持細(xì)胞器邊緣完整且不失真。最后，運(yùn)用形態(tài)學(xué)插值的方法對(duì)相鄰兩幅圖像進(jìn)行層間插值實(shí)現(xiàn)三維重建，輸出細(xì)胞的三維可視化結(jié)構(gòu)。

本文的研究成果將為細(xì)胞生物學(xué)和生物動(dòng)力學(xué)等方面的研究提供基礎(chǔ)，活細(xì)胞的三維可視化技術(shù)將大大提高細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的觀測效果。