孫煥平，王 凱

1 前言

膽固醇作為兩類最主要的細(xì)胞脂質(zhì)物質(zhì)之一，是真核細(xì)胞細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分。它是類固醇激素和膽汁酸的前體，是一種天然的生物活性劑，能夠作為信號(hào)分子參與多種細(xì)胞功能[1]。由于膽固醇對(duì)細(xì)胞的基本功能，當(dāng)維持膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)受到干擾會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重臨床病癥，如動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥和糖尿病等[2]。因此，機(jī)體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制能夠平衡細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜水平的膽固醇水平，以適應(yīng)生理變化的需要。機(jī)體通過甾醇生物合成，脂蛋白攝取，脂肪分解動(dòng)員固醇和內(nèi)流及外流的反饋調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平維持膽固醇穩(wěn)態(tài)[3]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是膽固醇穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。SREBP有三種主要亞型；SREBP-1a和SREBP-1c來自SREBP1基因中染色體11上的兩個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子，可產(chǎn)生獨(dú)特的5′非編碼區(qū)(5′UTR)氨基末端mRNA；SREBP-2來自SREBP2基因中染色體15上。SREBPs協(xié)調(diào)調(diào)控膽固醇和脂肪酸的生物合成，研究表明，SREBP-1c作為一種相對(duì)較弱的轉(zhuǎn)錄激活因子優(yōu)先參與脂肪酸代謝基因的激活，而SREBP-1a激活膽固醇和脂肪酸代謝基因；SREBP-2優(yōu)先激活膽固醇代謝的基因。

不同的SREBP亞型在轉(zhuǎn)錄水平上，通過不同的組織特異性信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行獨(dú)立調(diào)節(jié)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上大約1100種氨基酸前體被表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞固醇水平較低時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的SREBP前體形成復(fù)雜的SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體使氨基末端成熟的SREBP在其膜上被水解釋放。這些活性轉(zhuǎn)錄因子被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，誘導(dǎo)核內(nèi)與膽固醇生物合成，脂蛋白攝取和脂肪分解相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[4]。有研究表明，膽固醇水平能調(diào)控SREBP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，多不飽和脂肪酸等其他信號(hào)也能調(diào)節(jié)SREBP-1同系物的成熟[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內(nèi)源性的，由20-25個(gè)核苷酸非編碼組成的RNA，其能夠通過與自身目標(biāo)mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)不完全堿基配對(duì)，來誘導(dǎo)靶基因的降解或是翻譯抑制，從而完成對(duì)蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)[4]。另有研究表明，miRNA也可以通過與其他區(qū)域(包括5′UTR或蛋白質(zhì)編碼的外顯子)結(jié)合抑制mRNA的靶標(biāo)[5]。此外研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)miRNA不僅可以在mRNA的3′UTR中配對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)位，而且單獨(dú)mRNA也可被多個(gè)不同miRNA共同靶標(biāo)，這表明miRNAs利用協(xié)同作用調(diào)控基因表達(dá)[6]?，F(xiàn)已證實(shí)miRNA調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，涉及miRNA表達(dá)水平的改變與膽固醇代謝紊亂高度相關(guān)[2]。位于SREBP內(nèi)含子中的miRNA有助于維持體內(nèi)膽固醇平衡，影響高密度脂蛋白(HDL)生命周期[6]，改善脂肪酸代謝和胰島素信號(hào)釋放[7]。因此，miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用除了激活復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子外，還是維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的關(guān)鍵。

2 miRNA的生物合成及轉(zhuǎn)錄

miRNA在哺乳動(dòng)物的生物合成中，大多數(shù)miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)鏈的初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，隨后被加帽聚腺苷酸化并剪接產(chǎn)生pre-miRNA[7]。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)轉(zhuǎn)錄[8]。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)Drosha瞬間將pri-miRNA中間體切割成包含約70-90個(gè)核苷酸的莖環(huán)狀pre-miRNA。緊接著由Ran-GTP 依賴性核轉(zhuǎn)運(yùn)受體 Exportin5將pre-miRNA運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，并由細(xì)胞質(zhì)中Dicer酶進(jìn)一步處理以產(chǎn)生成熟的miRNA，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白(AGO)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，RISC通過不完全堿基配對(duì)使mRNA的3'UTR與miRNA的“種子”區(qū)域特異性結(jié)合，最后增強(qiáng)mRNA翻轉(zhuǎn)和/或轉(zhuǎn)錄抑制[9]。

miRNA表達(dá)受到組織特異性和發(fā)育階段異性控制。大多數(shù)miRNA基因轉(zhuǎn)錄是由RNA Pol II介導(dǎo)的，他們的啟動(dòng)子在蛋白質(zhì)基因編碼中被認(rèn)為具有序列特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[10]。事實(shí)上，高通量測(cè)序和生物信息學(xué)方法已經(jīng)揭示，miRNA基因近端上游區(qū)域具有TATA盒、啟動(dòng)子元素、TFIIB識(shí)別元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序[11]。此外，最近的研究已經(jīng)預(yù)測(cè)miRNA啟動(dòng)子區(qū)域接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，暗示表觀遺傳機(jī)制，如DNA甲基化和組蛋白修飾對(duì)miRNA表達(dá)調(diào)控的作用[12]。為了更好地理解miRNA基因的多樣性、功能和生物合成，需要關(guān)于替代、剪接啟動(dòng)子和miRNA基因加工的更詳細(xì)信息。

3 miRNA在膽固醇生物合成中的作用

3.1 膽固醇平衡調(diào)節(jié)回路：SREBP和miRNAs

研究表明，miRNA 能夠直接或者間接影響相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和催化酶的活性，參與膽固醇合成、運(yùn)輸，在機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)維持過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8，9]。

SREBP-1a和SREBP-1c參與脂肪酸和葡萄糖等能量代謝相關(guān)基因表達(dá)，而SREBP-2更具特異性的參與膽固醇代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)是主要的膜上膽固醇傳感器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不活躍的SREBP前體能夠直接與SCAP交互作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜閾值水平高于5mol/%時(shí)，SCAP直接結(jié)合膽固醇，并維持與胰島素誘導(dǎo)基因(insulin induced gene，INSIG)結(jié)合的構(gòu)象，促使SREBP進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膽固醇低于5%時(shí)，SCAP構(gòu)象發(fā)生改變，不再與INSIG相互作用。這使得SCAP與外被蛋白(coat protein Ⅱ，COP II)相互作用，將SCAP-SREBP復(fù)合物運(yùn)送至高爾基體。進(jìn)入高爾基體后，SREBP經(jīng)過位點(diǎn)1和位點(diǎn)2蛋白酶協(xié)同一致的兩步蛋白水解作用，釋放代表成熟轉(zhuǎn)錄因子的氨基區(qū)域并遷移至細(xì)胞核，激活SREBP靶基因的表達(dá)。細(xì)胞核內(nèi)SREBPs是不穩(wěn)定的，并能被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過靶向E3泛素連接酶F-box和F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)降解[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和人類肝臟組織中miR-183、miR-96、miR-182操縱子被SREBP-2直接激活。SREBP-2與TSS附近的miR-183/96/182轉(zhuǎn)錄單元的保守結(jié)合位點(diǎn)相互作用，促進(jìn)三個(gè)miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄。miR-182靶向FBXW7，miR-96靶向INSIG2，建立調(diào)節(jié)SREBP活性的正反饋回路，從而維持膽固醇穩(wěn)定[13, 14]。

另有研究表明，miR-24靶向INSIG1也會(huì)對(duì)SREBP水平產(chǎn)生積極影響[15]，但miR-24如何調(diào)控體內(nèi)SREBP平衡機(jī)制還有待確定。盡管如此，在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中拮抗miR-24仍能通過下調(diào)脂質(zhì)基因表達(dá)，顯著降低血漿和肝臟脂質(zhì)水平。在非酒精性脂肪肝或脂肪性肝炎患者中也觀察到高水平的miR-24以及更低水平的INSIGI[16]，說明miR-24和INSIGI之間的作用可能參與調(diào)控代謝性疾病中脂質(zhì)平衡。

miR-185表達(dá)受SREBP-1c調(diào)控， SREBP-1c與miR-185的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)特定基序結(jié)合。在這種情況下，通過體內(nèi)和體外靶向SREBP-2的3′UTR導(dǎo)致膽固醇代謝基因功能失活，例如羥基-3-甲基戊二?；?CoA還原酶(HMGCR)和低密度脂蛋白受體(LDLR)的表達(dá)降低。脂肪酸是膽固醇酯合成原料，而SREBP-1c主要調(diào)節(jié)脂肪酸的產(chǎn)生。這表明SREBP-1c/miR-185軸構(gòu)成膽固醇代謝反饋通路，維持有力膽固醇和膽固醇酯的比值[17]。需要進(jìn)一步的研究來了解miR-185在代謝性疾病中的生理作用。

3.2 膽固醇生物合成中的其他miRNA

在研究中抑制肝臟miR-122表達(dá)，導(dǎo)致小鼠血漿和肝臟的膽固醇和甘油三酯水平降低，表明miR-122對(duì)脂質(zhì)和脂肪酸氧化基因有重要影響。后續(xù)研究還顯示，減少miR-122可降低非人類靈長(zhǎng)類游離膽固醇水平[18]。因此，miR-122被認(rèn)為是潛在的新型降脂劑，提示它可能是一種治療靶點(diǎn)。然而，另一項(xiàng)研究顯示，在NASH患者中miR-122表達(dá)顯著下調(diào)，抑制miR-122促進(jìn)了人肝臟細(xì)胞中脂肪酸和膽固醇合成基因的表達(dá)[19]。這些相互矛盾的研究很可能是由于miR-122是肝臟中表達(dá)最高的miRNA之一，能夠通過多種途徑對(duì)正常肝功能產(chǎn)生重要影響。

NASH患者肝臟中miR-34a水平升高，這與SREBP-2增加有關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過抑制SIRT1基因使SREBP-2穩(wěn)定[21]。Lee等人發(fā)現(xiàn)，法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)通過激活轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制miR-34a的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)SIRT1的功能。在非酒精性脂肪肝病中miR-34a和p53升高與SIRT1被抑制相關(guān)[22]。熊去氧膽酸是一種天然的膽汁酸，可通過激活膽汁酸受體FXR來降低脂毒性和NAFLD，Castro等人報(bào)道稱這可能是FXR對(duì)miR-34a/SIRT1/p53軸的影響[23]。因此，miR-34a的上調(diào)可能促進(jìn)肝臟脂肪變性的發(fā)生和進(jìn)展，這表明抗miR-34a化合物能夠有效治療NAFLD和NASH。

最近研究顯示，細(xì)胞膽固醇水平能夠增加miR-223轉(zhuǎn)錄水平。在人肝細(xì)胞系中過表達(dá)的miR-223通過降低清道夫受體(SR-BI)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a合酶(HMGCS1)活性，抑制膽固醇吸收和生物合成，并通過促進(jìn)ABCA1基因表達(dá)提高膽固醇外流。此外，miR-223敲除小鼠通過誘導(dǎo)膽固醇生物合成基因(包括HMGCS1[24])，其血漿和肝臟表現(xiàn)出較高的膽固醇水平。這些結(jié)果表明，miR-223在調(diào)節(jié)全身膽固醇穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。

4 miRNA對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)

4.1 膽固醇外流與miRNA

除了生物合成外，調(diào)控過量膽固醇外流對(duì)維持膽固醇穩(wěn)態(tài)也是至關(guān)重要的。膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)促進(jìn)膽固醇外流至細(xì)胞外受體，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)顆粒。這個(gè)過程是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)的第一步，多余的膽固醇從外周細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，以便外排到膽汁和糞便中[25]。肝臟ABCA1失活會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)總HDL-c嚴(yán)重減少[26]。由于血漿HDL-C水平與心血管疾病呈負(fù)相關(guān)，因此ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出對(duì)于維持膽固醇動(dòng)態(tài)平衡和防止動(dòng)脈粥樣硬化至關(guān)重要。最近的研究表明，幾種miRNA靶向ABCA1，從而調(diào)節(jié)血漿HDL-C水平。其中，位于SREBP-2基因內(nèi)含子內(nèi)的miR-33a研究最為廣泛。miR-33a和SREBP-2由于共同表達(dá)，協(xié)同調(diào)控膽固醇合成吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，以維持細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)[27]。此外，抑制miR-33能夠顯著增加肝臟ABCA1表達(dá)，進(jìn)而增加小鼠體內(nèi)循環(huán)HDL-c水平[28]。miR-33a在物種間高度保守，而人類位于SREBP1基因內(nèi)含子中的miR-33b在嚙齒動(dòng)物中不存在。由于胰島素抵抗引起的高胰島素血癥持續(xù)誘導(dǎo)SREBP-1c表達(dá)，人體在這種條件下miR-33b顯著增加。這說明脂質(zhì)生物合成調(diào)節(jié)異常和膽固醇流出可能導(dǎo)致高脂血癥和心血管疾病。事實(shí)上，在胰島素抵抗的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中miR-33b和SREBP-1c都顯著增加[29]，通過miR-33拮抗作用調(diào)控miR-33靶基因(如ABCA1)，能夠顯著減低VLDL并增加HDL。盡管拮抗劑對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)或胰島素敏感性的作用尚未觀察到，但這些結(jié)果表明miR-33a / b靶向治療人類代謝疾病的治療潛力。

肝X受體(Liver X receptor，LXR)是膽固醇代謝的主要調(diào)控因子，能夠激活A(yù)BCA1、ABCG1等多種參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的基因[30]。最近的一項(xiàng)研究證明了這點(diǎn)，在巨噬細(xì)胞中miR-26被氧化甾醇激活，能夠靶向調(diào)控ABCA1和細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[31]。相反，在類似的條件下，miR-144被LXR上調(diào)，并靶向ABCA1，表明在膽固醇流出過程中存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)[32]。通過靶向LXR的3'UTR，肝臟miR-613參與LXR自動(dòng)的反饋調(diào)節(jié)循環(huán)。此外，激活核受體FXR能夠促進(jìn)miR-144表達(dá)，同時(shí)控制膽汁酸合成、排出和運(yùn)輸?shù)幕?。miR-144還抑制肝臟ABCA1并降低血漿HDL-C水平。使用FXR激動(dòng)劑可增加肝臟SR-BI的表達(dá)，促進(jìn)肝臟對(duì)HDL-c的吸收，提示FXR誘導(dǎo)的miR-144是RCT過程中將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁的有效補(bǔ)充途徑[33]。

4.2 HDL-c吸收與miRNA

肝臟和類固醇生成組織中SR-BI高度表達(dá)，能夠促使HDL-c釋放出膽固醇用于類固醇激素合成[34]。盡管血漿中低HDL-c水平是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志，但是提高HDL-c的益處仍存在爭(zhēng)議。即便是在血漿HDL-c水平極低的情況下，小鼠肝臟SR-BI過表達(dá)同樣能夠降低動(dòng)脈粥樣硬化程度。功能性獲得肝SR-BI可以選擇性增加HDL-c吸收，并增加殘留HDL顆粒的水平，這可能更有效的促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇外流，從而增加膽固醇外排至膽汁以及巨噬細(xì)胞膽固醇流出的總體速率。另一方面，敲除小鼠SR-BI基因?qū)е赂闻K分解HDL-c的代謝受損，HDL-c水平顯著升高，巨噬細(xì)胞RCT速率降低，小鼠更易受APOE- 或LDLR-缺陷引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化影響。這些結(jié)果表明，肝臟SR-BI可以影響RCT的總體速率，并且其表達(dá)的調(diào)控對(duì)于維持膽固醇穩(wěn)態(tài)具有重要意義。最近研究表明，人肝細(xì)胞系中miR-185、miR-96和miR-223都能夠抑制SR-BI和HDL-C攝取。在高脂飲食喂養(yǎng)APOE敲除小鼠中，其肝臟miR-96和miR-185表達(dá)顯著下調(diào)，而SR-BI表達(dá)增加，提示這兩種miRNA都可能調(diào)節(jié)血漿HDL-C水平和RCT[35]。此外，在高膽固醇喂養(yǎng)的小鼠肝臟中miR-96也顯著下調(diào)，從而抑制SREBP-2降低膽固醇合成[36]。因此，通過抑制miR-96能夠阻礙膽固醇合成并激活RCT，從而逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

5 展望

綜上所述，miRNA通過調(diào)節(jié)膽固醇生物合成、脂蛋白攝取、CRT等系統(tǒng)地維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)。因此，miRNA表達(dá)失調(diào)可能是引發(fā)膽固醇代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制。事實(shí)上，研究已經(jīng)證明，體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)是通過轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)維持。SREBPs、LXR和FXR等細(xì)胞內(nèi)甾醇傳感器已被鑒定為直接調(diào)節(jié)miRNA轉(zhuǎn)錄的因子，通過參與反饋或前反饋調(diào)節(jié)回路維持膽固醇穩(wěn)態(tài)。了解轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將揭示機(jī)體復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)代謝性疾病的治療提供堅(jiān)實(shí)的理論支持。