李文華 吳雅琴 馬國興 袁銘瑞 許瑞安

(華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 分子藥物教育部工程研究中心, 福建省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室, 廈門市海洋與基因工程藥物重點(diǎn)實驗室, 廈門 361021)

方格星蟲(Sipunculus nudus)又名裸體方格星蟲或光裸星蟲, 俗稱“沙蟲”, 隸屬于星蟲動物門, 方格星蟲綱, 方格星蟲科, 方格星蟲屬[1], 是一種名貴的海產(chǎn)珍品。目前, 關(guān)于方格星蟲繁殖生物學(xué)的研究甚少。方格星蟲為體外受精, 雌雄異體, 性成熟最短時間為11個月, 其生殖腺位于收吻肌基部, 腺體細(xì)小, 肉眼難以識別, 僅在排卵期明顯[2,3]。全年都可以在其體腔中觀察到生殖細(xì)胞, 生殖細(xì)胞的發(fā)育隨季節(jié)的變化而變化[4]。星蟲動物的配子發(fā)生過程比較特別, 原生殖細(xì)胞在發(fā)育早期便以單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的形式從性腺脫落進(jìn)入到體腔液中繼續(xù)發(fā)育至成熟, 發(fā)育成熟后進(jìn)入腎管[3,4]。方格星蟲具有1對細(xì)長的呈圓筒狀的腎管結(jié)構(gòu), 腎管一般作為排泄器官, 負(fù)責(zé)排出體腔中的代謝廢物[5]。在繁殖季節(jié), 腎管兼作生殖道, 負(fù)責(zé)收集體腔中的精卵并使之獲能。產(chǎn)卵前, 體腔內(nèi)成熟的生殖細(xì)胞通過內(nèi)腎孔進(jìn)入到腎管。產(chǎn)卵時, 成熟的生殖細(xì)胞通過外腎孔排出體外[6,7]。與大多數(shù)無脊椎動物的繁殖過程不同, 星蟲的繁殖生物學(xué)具有一定的特殊性, 其配子只有經(jīng)腎管收集并停留一段時間進(jìn)行最后的“激活包裝”才能完全成熟, 才具有受精能力[4,6,8—11]。

DMRT (Double-sex and mab3-related transcription factor)基因家族, 在動物性別決定和分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[12]。該家族共同的特征是含有保守的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Doublesex and mab-3, DM domain), 其中, DMRT基因家族中的dmrt1在性別決定、分化和器官功能維持上發(fā)揮著重要的作用, 已在哺乳動物、禽類、兩棲爬行類及硬骨魚類等發(fā)現(xiàn)[12—16]。人類(Homo sapiens)dmrt1定位于9號染色體, 該基因的缺失會導(dǎo)致精巢發(fā)育障礙[17], 在XY雄性小鼠(Mus musculus)中的研究結(jié)果顯示, 敲除dmrt1基因后嚴(yán)重影響睪丸分化和精子形成[18]。鳥類dmrt1對于精巢的分化也起著至關(guān)重要的作用, 且高表達(dá)的dmrt1基因決定了鳥類的性別[19]。非洲爪蟾(Xenopus laevis)中的一個位于W染色體上的dmrt1的復(fù)制本,DM-W, 被證明為非洲爪蟾的性別決定基因,DM-W的表達(dá)能夠阻止精巢的分化, 從而導(dǎo)致卵巢的發(fā)生[20,21]。青鳉(Oryzias la-tipes)dmrt1基因在Y染色體上的一個復(fù)制本Dmy(又叫Dmrt1y)是一個雄性特異的性別決定基因, 能促使雄性發(fā)生也是促使雄性發(fā)生所必須的基因[22,23]。與脊椎動物相比, 無脊椎動物dmrt1基因的研究報道尚少, Jennifer等[24]在無脊椎動物東部大螯蝦(Sagmariasus verreauxi)中克隆到定位于Y染色體上的一個DMRT基因的復(fù)制本iDMY。dmrt1作為不同物種間保守的性別相關(guān)基因, 尚沒有研究報道其在方格星蟲中的研究情況。本研究旨在克隆得到在海洋無脊椎動物方格星蟲生殖發(fā)育中的重要功能基因dmrt1的全長cDNA序列, 分析它的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1—1.5年齡方格星蟲(體長約15 cm)購買于廈門第八海鮮市場。抽取方格星蟲體腔液鑒定雌雄后, 取體腔液、腎管、神經(jīng)節(jié)、肌肉、翻吻肌和腸道組織用液氮速凍后, 置于-80℃保存, 用于成體組織實時熒光定量PCR。

1.2 方格星蟲SMART cDNA文庫構(gòu)建

取方格星蟲雄性個體的體腔液, 使用TRIzol(TaKaRa)提取總RNA, 然后用SMART cDNA合成試劑盒(Clontech)構(gòu)建SMART cDNA文庫?？俁NA的提取和SMART cDNA的合成參照產(chǎn)品說明書。

1.3 Dmrt1基因的cDNA序列擴(kuò)增

根據(jù)前期實驗獲得的部分dmrt1序列設(shè)計RACE擴(kuò)增引物(表 1), 然后使用以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 95℃變性15s, 60℃退火30s, 72℃延伸2min, 共36個循環(huán), 72℃加尾15min。將獲得的PCR產(chǎn)物上樣于1%的瓊脂糖凝膠中, 取適量目標(biāo)條帶切膠純化后的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接, 4℃過夜處理后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中, 篩選含有陽性插入片段的菌落進(jìn)行測序驗證和分析。

1.4 Dmrt1基因的序列分析

在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中, 利用方格星蟲DM結(jié)構(gòu)域檢索近緣物種DM結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列, 使用MUSCLE軟件對所有序列進(jìn)行對位排列, 并用BioEdit軟件對排列不整齊的序列進(jìn)行人工校正。選擇MEGA 7.0軟件, 基于Jones-Taylor-Thornton (JTT)模型, 將對位排列整齊的序列構(gòu)建鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹, 系統(tǒng)樹進(jìn)行1000次自展重復(fù), 其中大于50%的枝被認(rèn)為是可信的。

1.5 實時熒光定量PCR

分別提取雌雄方格星蟲體腔液、神經(jīng)節(jié)、腸道、肌肉、腎管和翻吻肌的總RNA。用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒合成單鏈cDNA, 具體操作步驟參見產(chǎn)品說明書。選擇方格星蟲β-actin作為內(nèi)參基因, 使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme)進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增, 具體操作程序和方法參見產(chǎn)品說明書,所用引物序列見表 1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.6 原位雜交

選取方格星蟲dmrt1的部分cDNA序列設(shè)計原位雜交引物, 為了獲得含有T7啟動子的目標(biāo)序列,我們分別在上下游引物的5′端插入T7啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGGAGA, 以獲得方格星蟲dmrt1正反義探針, 具體參見表 1, 然后通過常規(guī)PCR擴(kuò)增的方式獲得含有T7啟動子的方格星蟲dmrt1基因片段。接下來, 使用T7聚合酶(Roche)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄, 具體操作方法參見產(chǎn)品說明書。分別取雌雄方格星蟲體腔液涂布于載玻片上, 37℃烘干1h, 然后將切片進(jìn)行蛋白酶消化、多聚甲醛固定、RNA探針雜交、洗脫、封閉、抗體孵浴、染色及顯色等步驟[25]。

1.7 統(tǒng)計分析

熒光定量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示。對各實驗組的熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 取P＜0.05為顯著性差異閾值, 差異分析使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。樣品間基因表達(dá)量數(shù)據(jù)圖選用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 Dmrt1基因的序列特征分析

方格星蟲dmrt1全長cDNA含有1509 bp (Gen-Bank: MK182259), 其中開放閱讀框的長度為615 bp,5′-UTR的長度為145 bp, 3′-UTR的長度為749 bp, 共編碼204個氨基酸。同時, 我們擴(kuò)增出的方格星蟲dmrt1全長含有多腺苷酸化加尾信號AATAAA, 加尾信號位于poly (A)尾上游的18 bp處。

對方格星蟲dmrt1的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析, 顯示其與Dmrt家族成員具有極其相似且高度保守的DM結(jié)構(gòu)域, 將方格星蟲DM結(jié)構(gòu)域與已報道的其他物種DM結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對, 比對結(jié)果顯示方格星蟲DM結(jié)構(gòu)域與?？?Exaiptasia pallida)的DM結(jié)構(gòu)域一致性最高, 高達(dá)81%。此外,方格星蟲與其他海洋軟體動物, 如牡蠣(Crassostrea gigas)、珠母貝(Pinctada margaritifera)的DM結(jié)構(gòu)域的相似性也可達(dá)到72%, 且與脊椎動物人、小鼠、非洲爪蟾及斑馬魚(Danio rerio)的DM結(jié)構(gòu)域的一致性分別為72%、72%、70%及70%。

為了確定方格星蟲dmrt1基因的進(jìn)化關(guān)系, 我們構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示方格星蟲dmrt1基因與數(shù)據(jù)庫中已知的脊椎動物或海洋軟體動物都沒有表現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象(圖 1),暗示方格星蟲dmrt1基因與我們找到的這些物種的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。目前, 關(guān)于星蟲或其近緣物種的dmrt1基因的相關(guān)研究尚鮮有報道。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的不同物種DMRT1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of DMRT1 in species based on NJ method

2.2 方格星蟲dmrt1在雄性個體的體腔液中高表達(dá)

我們采用熒光定量PCR方法研究了dmrt1在不同組織(體腔液、神經(jīng)節(jié)、腸道、肌肉、腎管和翻吻肌)中的表達(dá)差異。方格星蟲dmrt1僅表達(dá)于雄蟲體腔液中, 在所檢測的其他組織包括神經(jīng)節(jié)、腸道、肌肉、腎管和翻吻肌中沒有表達(dá)(圖 2), 且在所檢測的雌性個體的各個組織(體腔液、神經(jīng)節(jié)、腸道、肌肉、腎管和翻吻肌)皆不表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究dmrt1在成體方格星蟲體腔液中的表達(dá)圖式, 我們抽取方格星蟲雌雄個體的體腔液, 采用方格星蟲dmrt1正、反義探針進(jìn)行了體腔液涂片原位雜交實驗。結(jié)果顯示, 雜交信號主要出現(xiàn)在雄性個體體腔液, 且主要集中在精子團(tuán)附近的滋養(yǎng)細(xì)胞中(圖 3A), 而在雌性個體體腔液中沒有檢測到雜交信號(圖 3B), 同時使用正義探針在雄性體腔液中也沒有檢測到雜交信號(圖 3C)。

3 討論

Dmrt1基因作為一個保守的性別相關(guān)基因, 廣泛參與哺乳類、爬行類、兩棲類和魚類的性別發(fā)育和分化過程, 在性別決定和生殖器官的功能維持等方面發(fā)揮著重要作用, 但該基因在不同進(jìn)化地位和不同性別決定機(jī)制的物種中的表達(dá)特性及功能不盡相同[12—16]。本研究從方格星蟲體腔液中克隆得到dmrt1基因, 生物信息學(xué)分析顯示dmrt1基因具有保守的DM結(jié)構(gòu)域, 同時通過熒光定量PCR, 我們報道了該基因主要表達(dá)于方格星蟲雄性個體的體腔液中。

圖2 方格星蟲dmrt1在不同組織中的熒光定量結(jié)果Fig. 2 The relative expression of dmrt1 in adult tissues of Sipunculus nudus

DM結(jié)構(gòu)域最早鑒定于果蠅中, 從無脊椎動物到脊椎動物DM結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出高度的進(jìn)化保守性[26]。方格星蟲DMRT1含有DM結(jié)構(gòu)域, 表明我們克隆的dmrt1基因符合DMRT家族成員的共有特征。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示方格星蟲DM結(jié)構(gòu)域與海洋軟體動物, 如海葵、牡蠣及珠母貝的一致性可達(dá)72%以上, 與脊椎動物人、小鼠和斑馬魚的DM結(jié)構(gòu)域一致性也能達(dá)到70%以上, 說明方格星蟲DMRT1具有一定的保守性。

圖3 方格星蟲dmrt1 mRNA在雌雄體腔液中的細(xì)胞定位Fig. 3 Cellular distribution of dmrt1 mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid

早有報道稱星蟲是一類有體腔、兩側(cè)對稱、身體不分節(jié)及外型像蟲的古老的海洋無脊椎動物,化石證據(jù)表明星蟲至少出現(xiàn)于后寒武紀(jì), 在5.2億年里, 星蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)幾乎沒有發(fā)生變化[27]。系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示方格星蟲dmrt1基因與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的部分脊椎動物和海洋軟體動物都沒有聚為一支(圖 1), 我們認(rèn)為其主要原因可能是星蟲類動物作為一種古老的海洋軟體動物, 尚沒有與其遺傳距離較近的物種報道克隆出dmrt1基因, 且星蟲類物種本身的繁殖生物學(xué)研究甚少, 已有研究也僅集中在生殖細(xì)胞形態(tài)、分類及組織學(xué)研究等方面[28—30]。綜上所述, 本文開啟了方格星蟲類動物在性別決定及分化相關(guān)基因研究, 為進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。

在已經(jīng)檢測的多數(shù)物種中,dmrt1都在雄性性腺或者雌性向雄性轉(zhuǎn)變的性腺中高表達(dá)[13]。方格星蟲dmrt1在6個所檢測的成體(雌蟲和雄蟲)組織中, 主要表達(dá)于雄蟲體腔液中(圖 2)。星蟲動物的原生殖細(xì)胞在發(fā)育早期以單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的形式從肉眼難以識別的性腺上脫落進(jìn)入到體腔液中繼續(xù)發(fā)育, 形成的生殖細(xì)胞附著于具有運(yùn)動能力的滋養(yǎng)細(xì)胞基部[3,31]。方格星蟲雄性生殖細(xì)胞一般以精細(xì)胞團(tuán)形式存在, 卵細(xì)胞以單個游離形式存在[31]。原位雜交實驗結(jié)果顯示方格星蟲dmrt1的雜交信號主要出現(xiàn)在精子團(tuán)附近的滋養(yǎng)細(xì)胞中(圖 3A), 蘭寶國等[4]認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞帶著生殖細(xì)胞一起運(yùn)動, 從而有利于生殖細(xì)胞從體腔液中攝取營養(yǎng)。哺乳動物精巢中有一類重要的細(xì)胞, 即支持細(xì)胞(Sertoli cells), 它為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營養(yǎng)[32], 我們認(rèn)為方格星蟲雄性體腔液中的滋養(yǎng)細(xì)胞可能與哺乳動物精巢中的支持細(xì)胞具有類似的功能, 因此推測方格星蟲dmrt1可能與其雄性決定和精子發(fā)生相關(guān)聯(lián), 而具體生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步的研究。