楊小蓉,馬 良,許 磊,趙晨璐,周建民

(1.中牧實業(yè)股份有限公司,北京 豐臺100070;2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室,北京 海淀 100095;3.北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)研究中心,北京 海淀 100095)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起豬的一種急性、高度接觸性、致死性腸道傳染病,臨床特征為腹瀉、嘔吐、脫水,各種年齡段和品系的豬群均易感[1]。該病于1971 年首次被報道后,相繼在亞洲及南美暴發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失,我國以CV777 疫苗株研制的商品化弱毒疫苗可有效防控PED 的流行。但2010 年秋冬PED 在中國多個省份暴發(fā)并迅速波及到全國以來,呈高發(fā)病率、高死亡率的特點[2]。近幾年P(guān)ED流行范圍不斷擴大,成為嚴重危害中國養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一[3]。

PEDV 基因組為線性單股正鏈RNA 病毒,屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)成員[1]。PEDV 的S 蛋白,在識別靶細胞以及病毒和細胞膜融合過程中發(fā)揮重要作用,能刺激機體產(chǎn)生中和抗體,在抗病毒免疫機制中發(fā)揮著重要作用[4]。S 蛋白目前認為是可用于監(jiān)測PEDV 的變異及流行趨勢的基因,也與疫苗的有效性密切相關(guān)[5]。本研究對2015-2018 年北方地區(qū)流行的PED 病原的S 基因進行了測序,與國內(nèi)外參考毒株進行遺傳變異分析,構(gòu)建了進化樹,了解PEDV 的變異趨勢,以期為疫病防控和疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2015-2018 年來自黑龍江、吉林、北京、山東、河北、山西、河南等北方省份發(fā)病豬場采取的病料。

1.2 試劑材料 病毒RNA 提取試劑盒、病毒RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA 聚合酶和dDNP 等試劑,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒RNA 的提取及S 基因RT-PCR 擴增測序 采用Viral RNA kit 試劑盒進行病毒核酸的提取純化,將提取的RNA 采用First-Stand cDNA kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。

根據(jù)GenBank 發(fā)表的PEDV 序列設(shè)計了5 對PEDV S 基因擴增引物。PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物各1μL,cDNA 2 μL,高保真Taq酶1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃4 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃30 s,共34 循環(huán);72 ℃8 min。

用1%瓊脂凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行觀察,然后對PCR 陽性產(chǎn)物進行回收,送北京鉑尚公司進行測序。

1.4 序列拼接與分析 應(yīng)用DNAStar、ClustalX、GeneDoc 等生物學軟件進行S 基因的拼接,與Gen-Bank 收錄的國內(nèi)外參考毒株進行比對與分析。用于本試驗分析的毒株見表1。

表1 試驗中所用的PEDV 毒株及來源

2 結(jié)果與分析

2.1 S 基因核苷酸序列及其推導編碼的氨基酸序列同源性分析 通過應(yīng)用軟件分析發(fā)現(xiàn),本試驗獲得的10 個PEDV S 基因序列相互之間核苷酸相似性為96.8%～99.4%,其推導的氨基酸相似性為96.5%～99.3%。其中,CH-HBhs1803、CH-SDbz1804、CH-SDdy1804、CH-SXyc1803、CH-HBcz-1702 和 CH-HNny-1611 共6 株序列基因長度均為4 158 nt,編碼1 385 個氨基酸;CH-SDbz1803、CH-BJCP1509、CH-HLJqqhe1803和CH-JLSP-1504 共4 株序列基因長度均為4 161 nt,編碼1 386 個氨基酸。

表2 S 基因核苷酸及推導編碼的氨基酸序列與國內(nèi)外參考毒株同源性比較 /%

2.2 依據(jù)S 基因推導編碼的氨基酸序列繪制遺傳進化樹 利用MEGA 6 軟件對所獲得的10 個S 基因和國內(nèi)外具有代表性的27 個毒株序列進行多序列比較,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖1)。

從進化樹圖譜中顯示,PEDV 流行毒株依據(jù)S基因推導的氨基酸構(gòu)建進化樹,可以分為G1 群和G2 群。G1 可以進一步分為以CV777 為代表毒株的經(jīng)典G1a 亞群,以及以CH-ZWC-01-2015 和USA/Iowa106/2013 為代表的G1b 亞群。G2 亞群可分為G2a 和G2b 兩個亞群,其中G2b 亞群可進一步分為以G2ba 亞群和G2bb 亞群。與國內(nèi)外參考毒株相比,本研究擴增得到的8 個S 基因序列位于以YnP1 spike、CH1 和GD-A 為代表的G2bbb 亞群,而CHHLJqqhe1803 位于以CH-YZC-02-2014 為代表的G2bba 亞群,CH-JLSP-1504 位于以CH_weishi_2016為代表的G2ba 亞群。

10 個S 基因序列與國內(nèi)流行毒株CH-XDC-2015親緣性更近,推導編碼的氨基酸與CH-XDC-2015 相似性為97.7%～99.4%;與疫苗株CV777-VAC 親緣性較遠,推導編碼的氨基酸與CV777-VAC 相似性為92.0%～93.1%;與經(jīng)典株CV777 親緣性較遠,推導編碼的氨基酸與CV777 相似性為92.6%～93.7%。由此說明病毒在流行過程中,發(fā)生了變異,與疫苗株相似性較低。

圖1 依據(jù)S 基因推導的氨基酸繪制進化樹

2.3 S 基因推導編碼氨基酸序列的變異分析 本試驗共得到10 個S 基因序列,與親緣性更近的國內(nèi)流行毒株CH-XDC-2015 進行序列比對,其推導編碼的氨基酸序列存在缺失和點突變。尤其存在特征性的氨基酸缺失,CH-HBcz-1702 毒株存在131 位I缺失;CH-HBhs1803、CH-SDbz1804、CH-SDdy1804、CH-SXyc1803 和CH-HNny-1611 共5 個毒株存在1 196 位N 缺失。與CH-XDC-2015、CV777 等流行毒株相比,10 個毒株在核心表位COE 結(jié)構(gòu)域(499～638 位氨基酸區(qū)域,有中和表位)存在氨基酸變異。

表3 S 蛋白氨基酸核心表位COE 結(jié)構(gòu)域的變異

3 討論

S 蛋白是PEDV 的一種結(jié)構(gòu)蛋白,通過S 蛋白能把病毒粒子吸附在宿主細胞受體上,然后通過膜融合滲進細胞中,以刺激宿主誘導產(chǎn)生中和抗體,因此S 蛋白具有PEDV 抗原的作用[5-6]。而PEDV的核心表位(COE)存在于S 蛋白的編碼基因中,被認為是PEDV 的亞單位疫苗的重要靶標抗原[4]。

基于S 基因核苷酸序列分析,2015-2018 年國內(nèi)發(fā)生的PEDV 可分為3 個亞群,其中8 個S 基因序列位于以YnP1 spike、CH1 和GD-A 為代表的G2bbb 亞群,而CH-HLJqqhe1803 位于以CH-YZC-02-2014 為代表的G2bba 亞群,CH-JLSP-1504 位于以CH_weishi_2016 為代表的G2ba 亞群。結(jié)合核苷酸及其推導的氨基酸變異分析發(fā)現(xiàn),S 基因變異株已經(jīng)成為優(yōu)勢流行毒株。其中6 株S 基因推導的氨基酸序列已分別在131 位、1196 位出現(xiàn)1 個氨基酸缺失。10 個毒株在核心表位COE 結(jié)構(gòu)域(499-638位氨基酸區(qū)域,有中和表位)均存在不同程度的氨基酸變異。10 個S 基因序列在進化樹中已形成多個小分支,相對來說與國內(nèi)流行毒株CH-XDC-2015親緣性更近,其推導編碼的氨基酸與以CH-XDC-2015 為代表的變異株相似性為97.7%～99.4%;與疫苗株CV777-VAC 親緣性較遠,推導編碼的氨基酸與CV777-VAC 相似性為92.0%～93.1%;與經(jīng)典株CV777 親緣性較遠,推導編碼的氨基酸與CV777相似性為92.6%～93.7%。由此說明目前養(yǎng)殖場暴發(fā)的PEDV 在流行過程中,已經(jīng)發(fā)生了變異,與疫苗株相似性程度較低。目前,經(jīng)典毒株CV777 滅活疫苗對于我國PEDV 疫病的防控起著重要作用。而S 基因序列變異株的出現(xiàn),則可能導致現(xiàn)有疫苗失去保護作用[7]。因此,監(jiān)測PEDV 的S 基因變異趨勢,對于制定防控策略和疫苗開發(fā)均有重要指導意義。