劉家祺,白燕雨,熊云梅,郭 耀,喬婷婷,段晉偉,唐 芳,霍乃蕊,古少鵬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

葡萄球菌廣泛分布在空氣、水和土壤環(huán)境中,健康動(dòng)物的體表和呼吸道中也存在大量的葡萄球菌,感染人、畜后以化膿性炎癥為主要特征。牛葡萄球菌病多發(fā)于奶牛,引起急慢性乳腺炎,導(dǎo)致生產(chǎn)力嚴(yán)重受損[1];羊體表、呼吸道及消化道受到葡萄球菌(主要是金黃色葡萄球菌)感染一般會(huì)引起毛囊炎、皮下膿腫、食物中毒、胃腸炎、氣管炎及肺炎等疾病[2]。目前,我國(guó)牛、羊養(yǎng)殖業(yè)由傳統(tǒng)的散養(yǎng)向集約化、工廠化發(fā)展,高密度養(yǎng)殖方式加劇了養(yǎng)殖環(huán)境的污染,大量的致病性及非致病性細(xì)菌氣溶膠極易直接或間接引發(fā)人、畜的各類疾病[3],動(dòng)物圈舍內(nèi)、外細(xì)菌氣溶膠來(lái)源復(fù)雜,畜禽自身、糞便、飼料和墊草及空氣中懸浮物均可形成細(xì)菌氣溶膠,威脅動(dòng)物與養(yǎng)殖場(chǎng)周邊居民健康[4]。本試驗(yàn)檢測(cè)了牛、羊場(chǎng)及外環(huán)境四季氣載葡萄球菌濃度變化,以及葡萄球菌氣溶膠粒譜特點(diǎn),以期為牛、羊場(chǎng)氣載葡萄球菌危害評(píng)估和養(yǎng)殖環(huán)境控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牛、羊場(chǎng)概況 牛場(chǎng)：奶牛舍為半開(kāi)放式,設(shè)有運(yùn)動(dòng)場(chǎng),每棟牛舍飼養(yǎng)奶牛100 頭,采用自然通風(fēng)采光。飼養(yǎng)量300 頭,專人每天打掃衛(wèi)生,消毒1 次/周。羊場(chǎng)：羊舍結(jié)構(gòu)為半開(kāi)放式,無(wú)運(yùn)動(dòng)場(chǎng),高床平養(yǎng),自動(dòng)出糞,飼養(yǎng)密度為0.5 只/m2,每棟飼養(yǎng)量500 只,自然通風(fēng)結(jié)合風(fēng)機(jī)換氣。

1.2 采樣地點(diǎn) 分別于牛舍外的上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 及下風(fēng)向100 m 處各選取1個(gè)采樣點(diǎn);牛舍內(nèi)選取3 個(gè)采樣點(diǎn);奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)選取3 個(gè)采樣點(diǎn);在羊場(chǎng)外上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 及下風(fēng)向100 m 處各選取1 個(gè)采樣點(diǎn);羊舍內(nèi)選取3 個(gè)采樣點(diǎn)。

1.3 主要試劑及儀器 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司,02-276);Baird-Park 瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物公司,HB4115);營(yíng)養(yǎng)肉湯(Solarbio,N8300);脫纖維綿羊血;Andersen 6 級(jí)空氣生物收集器(Tisch environment,USA),捕獲粒子直徑范圍見(jiàn)表1。

表1 Andersen-6 級(jí)采樣器捕獲粒子直徑范圍

1.4 空氣樣本采集 應(yīng)用Andersen-6 級(jí)空氣微生物收集器分別于春、夏、秋、冬四季中連續(xù)3 d 采集牛羊場(chǎng)及周圍環(huán)境的空氣樣本,并記錄當(dāng)時(shí)的氣溫、相對(duì)濕度及風(fēng)速等環(huán)境參數(shù),采樣介質(zhì)為5%綿羊血瓊脂,模擬牛、羊呼吸高度進(jìn)行采樣,采樣流量28.3 L/min,采樣時(shí)間為3 min,每點(diǎn)3 次重復(fù),并設(shè)空白對(duì)照。

1.5 樣本的處理(1)分離培養(yǎng)將采樣后的5%綿羊血瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),倒置培養(yǎng)24～48 h。用無(wú)菌接種環(huán)挑取血平板上的全部菌落,革蘭染色鏡檢后,將鏡檢為葡萄串狀的革蘭陽(yáng)性菌株,接種到BP 培養(yǎng)基上,將生長(zhǎng)邊緣淡灰色到黑色的菌落計(jì)為葡萄球菌;(2)菌落計(jì)數(shù)依據(jù)5%綿羊血瓊脂平板生長(zhǎng)的菌落數(shù),計(jì)算每立方米空氣中所含需氧菌及葡萄球菌總數(shù)(CFU/m3),計(jì)算公式如下：每立方米空氣中所含的細(xì)菌總數(shù)=六級(jí)平皿上細(xì)菌數(shù)÷28.3 L/min×采樣時(shí)間(min)×1 000。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析(1)空氣中微生物呈非正態(tài)分布,本試驗(yàn)氣載葡萄球菌含量均使用中間值表示,此統(tǒng)計(jì)方式適合此統(tǒng)計(jì)方式適合運(yùn)用在數(shù)值較小但波動(dòng)較大的樣本統(tǒng)計(jì),并用最大值和最小值反應(yīng)各樣本之間數(shù)值的波動(dòng)范疇[5],平均值為中間值的平均數(shù)。中間值計(jì)算公式：

若n為奇數(shù),則Md=X(n+1)/2;若n為偶數(shù),則Md=(Xn/2+Xn/2+1)/2。

(2)細(xì)菌氣溶膠粒譜特征以計(jì)數(shù)中值直徑(CMD)表示,細(xì)菌粒徑分布的離散度以幾何標(biāo)準(zhǔn)差GSD 表示,人的通氣量按6.94×10-3m3/min 計(jì)算,牛通氣量按1.44×10-1m3/min[6],羊的通氣量按5.70×10-3m3/min 計(jì)算[7]。

Andersen-6 級(jí)空氣采樣器第Ⅰ、Ⅱ級(jí)收集的細(xì)菌粒子直徑＞6 μm,可進(jìn)入人畜淺部呼吸道,第Ⅲ～Ⅵ級(jí)收集的細(xì)菌粒子直徑≤5 μm,可沉著在細(xì)支氣管甚至直接進(jìn)入肺泡[8]。可進(jìn)入呼吸道淺部、深部的細(xì)菌粒子量分別對(duì)應(yīng)采樣器的第Ⅰ、Ⅱ級(jí)和第Ⅲ～Ⅵ級(jí)。

2 結(jié)果

2.1 牛、羊場(chǎng)環(huán)境空氣中葡萄球菌的濃度

2.1.1 牛場(chǎng)空氣中葡萄球菌的濃度 牛場(chǎng)四季環(huán)境氣載葡萄球菌濃度在0.16×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3之間,冬季濃度最高,夏季次之,春季最低,在牛舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 和下風(fēng)向100 m 處氣載葡萄球菌占?xì)廨d需氧菌的比例分別為79.14%、71.63%、55.93%、55.93%、62.40%、63.41%。牛舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 和下風(fēng)向100 m氣載葡萄球菌濃度分別為1.15×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3、1.22×103CFU/m3～4.27×103CFU/m3、0.16×103CFU/m3～0.5×103CFU/m3、0.56×103CFU/m3～1.23×103CFU/m3、0.49×103CFU/m3～1.07×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～0.75×103CFU/m3,氣載葡萄球菌濃度平均值以牛舍最高,上風(fēng)向10 m 處最低,在牛舍下風(fēng)向處的氣載葡萄球菌含量隨著與圈舍距離增大而逐漸減小,見(jiàn)圖1。

圖1 牛場(chǎng)氣載葡萄球菌含量

2.1.2 羊場(chǎng)空氣中葡萄球菌的濃度 羊場(chǎng)四季環(huán)境氣載葡萄球菌濃度在0.22×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3之間,夏季濃度最高,冬季次之,春季最低,羊舍、上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 和下風(fēng)向100 m 氣載葡萄球菌占?xì)廨d需氧菌的比例分別為74.86%、67.16%、59.30%、67.83%、68.97%。羊舍、上風(fēng)向10 m、下風(fēng)向10 m、下風(fēng)向50 m 和下風(fēng)向100 m氣載葡萄球菌濃度分別為1.27×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3、0.22×103CFU/m3～0.81×103CFU/m3、0.74×103CFU/m3～1.96×103CFU/m3、0.28×103CFU/m3～1.5×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～1.19×103CFU/m3,氣載葡萄球菌濃度平均值以羊舍最高,上風(fēng)向10 m 處最低,羊舍下風(fēng)向處的氣載葡萄球菌含量隨著與圈舍距離增大而逐漸減小,見(jiàn)圖2。

圖2 羊場(chǎng)氣載葡萄球菌含量

2.2 牛、羊場(chǎng)環(huán)境氣載葡萄球菌的空氣動(dòng)力學(xué)特征

2.2.1 牛場(chǎng)環(huán)境葡萄球菌氣溶膠顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)特點(diǎn) 牛場(chǎng)環(huán)境中葡萄球菌氣溶膠顆粒主要分布在采樣器的第Ⅵ、Ⅴ級(jí),峰值均出現(xiàn)在第Ⅵ級(jí)(2.1～3.3 μm),次峰均在第Ⅴ級(jí)(1.1～2.1 μm),第Ⅲ～Ⅵ級(jí)占比為72.89%～84.73%,見(jiàn)圖3。

圖3 牛場(chǎng)各采樣點(diǎn)氣載葡萄球菌在采樣器上的分布

2.2.2 羊場(chǎng)環(huán)境葡萄球菌氣溶膠顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)特點(diǎn) 羊場(chǎng)環(huán)境中氣載葡萄球菌主要分布在采樣器的第Ⅰ、Ⅳ級(jí),峰值均出現(xiàn)在第Ⅰ級(jí)(＞7 μm),次峰均在第Ⅳ級(jí)(2.1～3.3 μm);第Ⅲ～Ⅵ級(jí)占比為53.33%～62.75%,見(jiàn)圖4。

圖4 羊場(chǎng)各采樣點(diǎn)氣載葡萄球菌在采樣器上的分布

2.2.3 葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 和GSD 值 牛場(chǎng)環(huán)境葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值為2.30 μm～2.67 μm,其中牛舍最低;GSD 為1.85～1.92;羊場(chǎng)環(huán)境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值為3.09 μm～3.56 μm,其中羊場(chǎng)下風(fēng)向10m 處最低;GSD 為1.68～1.84。

2.2.4 到達(dá)人畜呼吸道不同部位的葡萄球菌粒子量 在牛舍中,人和牛每分鐘可吸入至肺部深處的葡萄球菌粒子量最高可達(dá)16.29 CFU 和337.97 CFU,高于其他采樣點(diǎn),并且在下風(fēng)向處隨著與牛舍距離增大,人畜每分鐘可吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐漸減小,詳見(jiàn)表2。

表2 牛場(chǎng)環(huán)境氣載葡萄球菌在呼吸道不同部位的到達(dá)量 (CFU/min)

在羊舍中,人和羊每分鐘可吸入至肺部深處的葡萄球菌粒子量最高可達(dá)11.28 CFU 和9.26 CFU,高于其他采樣點(diǎn),并且在下風(fēng)向處隨著與羊舍距離增大,人畜每分鐘吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐漸減小,見(jiàn)表3。

表3 羊場(chǎng)環(huán)境氣載葡萄球菌在呼吸道不同部位的到達(dá)量 (CFU/min)

3 討論

3.1 牛、羊舍環(huán)境四季氣載葡萄球菌濃度 牛舍內(nèi)氣載葡萄球菌含量冬季最高,春季最低,與冬季舍內(nèi)密封較嚴(yán)、風(fēng)速小、濕度大,舍內(nèi)通風(fēng)換氣慢,環(huán)境適宜葡萄球菌生長(zhǎng)有關(guān);春季風(fēng)速較大,空氣流動(dòng)快,舍內(nèi)濕度小,氣載葡萄球菌含量較低。我們測(cè)得牛舍內(nèi)氣載葡萄球菌濃度平均值為2.77×103CFU/m3,遠(yuǎn)高于段會(huì)勇[9]兔舍氣載葡萄球菌含量均值2.74×102CFU/m3的測(cè)定結(jié)果,柴同杰[10]指出的無(wú)墊草奶牛舍氣載需氧菌濃度應(yīng)低于2.5×103CFU/m3,葡萄球菌屬需氧菌,該牛舍氣載需氧菌含量必定超出此界值,需改善環(huán)境衛(wèi)生。

羊舍內(nèi)氣載葡萄球菌濃度夏季最高,春季最低,本試驗(yàn)研究對(duì)象是舍飼羊場(chǎng),羊舍夏季氣溫較高,舍內(nèi)通風(fēng)差,葡萄球菌濃度較高;春季風(fēng)速大,舍內(nèi)無(wú)動(dòng)力風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)較快,環(huán)境衛(wèi)生得到改善。關(guān)于羊舍氣載需氧菌的最低限量,目前未見(jiàn)報(bào)道,但羊舍內(nèi)氣載葡萄球菌含量均值為2.59×103CFU/m3,遠(yuǎn)高于一般環(huán)境。

養(yǎng)殖場(chǎng)氣載葡萄球菌濃度夏冬兩季較高,春季最低,這與鐘召兵[11]研究一致。葡萄球菌是主要的環(huán)境細(xì)菌,在本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛、羊舍內(nèi)氣載葡萄球菌含量較高,Crowe[12]等認(rèn)為,環(huán)境中高濃度的氣載微生物可造成動(dòng)物和人員的抵抗力和免疫力下降,對(duì)傳染性疾病易感性增強(qiáng),因此必須注重圈舍空氣的清潔和消毒。

3.2 牛、羊場(chǎng)氣載葡萄球菌的散播 本試驗(yàn)表明,牛、羊舍及其下風(fēng)向處氣載葡萄球菌的含量均隨距離養(yǎng)殖場(chǎng)的距離逐漸增大而減小,散播距離超過(guò)100 m;柴同杰等[13]在雞舍下風(fēng)向(10～400 m)分離的57.1%金黃色葡萄球菌與舍內(nèi)空氣與糞便樣本中采集的相同;黃藏宇[14]的研究顯示,豬舍內(nèi)氣載需氧菌含量與舍外下風(fēng)向10 m、20 m、25 m 和30 m處空氣無(wú)明顯差異,以上均表明動(dòng)物圈舍內(nèi)氣載葡萄球菌可向舍外較大距離散播。圈舍內(nèi)衛(wèi)生、飼養(yǎng)密度以及風(fēng)速、風(fēng)向等因素均會(huì)影響舍內(nèi)微生物氣溶膠傳播的距離與強(qiáng)度[15],因此養(yǎng)殖場(chǎng)建設(shè)時(shí)選址應(yīng)與居民區(qū)保持一定距離。

3.3 牛、羊場(chǎng)氣載葡萄球菌空氣動(dòng)力學(xué)分析 本試驗(yàn)中使用的Andersen-6 級(jí)微生物收集器可根據(jù)空氣中微生物顆粒直徑大小不同而采集在不同的級(jí)上,采樣器模擬呼吸道可判斷微粒到達(dá)部位,收集在第Ⅰ、Ⅱ級(jí)上的微粒能夠侵入鼻咽喉及氣管,收集在采樣器第Ⅲ到Ⅵ級(jí)上的微粒能夠沉著在支氣管和細(xì)支氣管最終進(jìn)入肺泡中[16-17]。所以,依據(jù)空氣中微生物到達(dá)的采樣器的不同級(jí),可模擬微粒到達(dá)呼吸系統(tǒng)的部位,從而推斷氣載微生物對(duì)人畜健康的威脅程度。

本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明,牛舍內(nèi)氣載葡萄球菌的40.39%、30.54%散布在Andersen-6 級(jí)收集器的第Ⅳ、Ⅴ級(jí)上,84.73%分布在Andersen-6 級(jí)采樣器的第Ⅲ到Ⅵ級(jí)上,這一部分葡萄球菌能到達(dá)人、畜深部呼吸道和肺泡。羊場(chǎng)內(nèi)氣載葡萄球菌的22.55%分布在采樣器第Ⅳ級(jí),分布在采樣器第Ⅲ到Ⅵ級(jí)的氣載葡萄球菌占總數(shù)的62.75%。李曉霞[18]等對(duì)國(guó)內(nèi)醫(yī)院室內(nèi)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的粒度分布研究發(fā)現(xiàn),超過(guò)50%的氣載金黃色葡萄球菌及其中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均分布在采樣器第Ⅲ～Ⅵ級(jí),可直接到達(dá)肺部引起感染;于歡[19]等發(fā)現(xiàn),羊舍真菌氣溶膠80%分布在采樣器第Ⅲ～Ⅴ級(jí),可引起肺炎及毒素中毒;Kim[20]等也認(rèn)為吸入分布在采樣器第Ⅲ～Ⅵ級(jí)的微生物后會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害。

牛場(chǎng)及外環(huán)境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值均小于3 μm,且牛舍處最高,提示牛場(chǎng)及外環(huán)境葡萄球菌氣溶膠粒子可進(jìn)入人和牛呼吸道深部甚至肺泡的葡萄球菌氣溶膠粒子比例最大,粒徑分布離散度GSD 較小,說(shuō)明大量的葡萄球菌可到達(dá)人畜呼吸系統(tǒng)深部;羊舍及外環(huán)境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值接近3 μm,且各采樣點(diǎn)的GSD 值相差較小,提示羊場(chǎng)氣載葡萄球菌可進(jìn)入人畜呼吸道深部的數(shù)量大、濃度高,危害性較大。