田萬年,劉 杰,張馨月,薛書江,賈立軍,張守發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,吉林 吉林132101;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesiosis)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲(Babesia ovata)寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲病。在我國,牛卵形巴貝斯蟲病主要傳播媒介為長角血蜱,主要分布于我國的河南、四川、甘肅和吉林等省份。該病危害嚴(yán)重,病牛臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿,多引起死亡。卵形巴貝斯蟲AMA1 基因在侵染宿主細(xì)胞中具有介導(dǎo)粘附和入侵宿主細(xì)胞的作用,具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性[1]。目前國內(nèi)尚未見有關(guān)牛卵形巴貝斯蟲病的重組蛋白與免疫方面研究。鑒于以上情況,本試驗(yàn)對(duì)卵形巴貝斯蟲AMA1 基因進(jìn)行克隆和表達(dá),并進(jìn)行反應(yīng)原性分析,為進(jìn)一步建立該病的免疫診斷方法及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本來源 采自吉林省琿春市散養(yǎng)延邊黃牛,經(jīng)血涂片鏡檢陽性的抗凝血,-20 ℃冰箱保存。卵形巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、酶標(biāo)羊抗牛IgG由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)玄學(xué)南教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 pMD18-T 載體、pGEX-4T-1 載體、T4 DNA 連接酶,均購自Promega 公司;E.coliJM109、E.coliBL21、XhoⅠ、EcoRⅠ、TaqDNA 聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。DMEM 為美國Life Technolongies 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 上登錄的卵形巴貝斯蟲AMA1 基因序列(KT312793),利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)了1 對(duì)特異性引物。上下游引物5′端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(下劃線部分)。上游引物為5′-ACGAATTCGATACGGCTGTCGGTAGCAA-3′,下游引物為5′-CCGCTCGAGGAGCTGTCACCATTGTCCTTAA-3′。擴(kuò)增目的片段大小為1 042 bp,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 AMA1 目的基因的克隆 按照全血基因組DNA 提取試劑盒方法提取基因組DNA。以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后與克隆載體pMD18-T 連接,轉(zhuǎn)化到E.coliJM109。采用試劑盒方法提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR 鑒定為陽性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)在線軟件TMHMM2.0 及DNAMAN 軟件對(duì)克隆的卵形巴貝斯蟲AMA1 基因核苷酸、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 分別提取陽性克隆和表達(dá)載體pGEX-4T-1 質(zhì)粒DNA,分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切后產(chǎn)物進(jìn)行連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。將鑒定為陽性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 取經(jīng)鑒定為陽性的重組菌100 μL 接種到10 mL Amp/LB培養(yǎng)基內(nèi),待細(xì)菌培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6 時(shí),加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行離心,棄上清,用PBS(pH 值7.4)洗滌沉淀2 次,加入5×上樣緩沖液、2 mol/L DTT,煮沸5 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。按常?guī)方法制備12%分離膠和5%濃縮膠,將處理好的樣品取15 μL上樣。電泳產(chǎn)物置于考馬斯亮蘭R250 中染色、脫色,在凝膠成像儀下觀察。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot 分析 將SDSPAGE 電泳凝膠轉(zhuǎn)印到NC 膜上,進(jìn)行免疫印跡。一抗選用牛卵形巴貝斯蟲陽性血清,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IgG,在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 卵形巴貝斯蟲AMA1 基因的克隆與鑒定 以基因組DNA 為模板,經(jīng)PCR 擴(kuò)增后獲得大小約為1 042 bp目的片段,與預(yù)期結(jié)果相一致(見圖1)。將目的基因克隆到pMD18-T 載體上,將陽性菌液進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示,與GenBank 收錄的牛卵形巴貝斯蟲AMA1 基因(KT312793)同源性為99.8%。

圖1 卵形巴貝斯蟲PCR 擴(kuò)增

2.2 生物信息學(xué)分析 克隆的卵形巴貝斯蟲AMA1 基因經(jīng)DNAMAN 軟件分析,ORF 大小為1 042 bp,編碼347 個(gè)氨基酸,分子量大小為42 ku。應(yīng)用TMHMM Server 2.0 軟件在線預(yù)測(cè)顯示,該蛋白在膜外的可能性接近于1(見中插彩版圖2),推測(cè)該蛋白為膜外蛋白,可在大腸桿菌中表達(dá)。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 篩選為陽性的重組pGEX-4T-BoAMA1 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 鑒定和酶切鑒定。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,獲得一條約為1 042 bp 的目的片段,與預(yù)期的大小相符(見圖3);用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切后,獲得約為2 600 bp和1 042 bp 的2 條目的片段(見圖4),目的基因片段成功插入到原核表達(dá)載體中。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-BoAMA1 的PCR 鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-BoAMA1 的酶切鑒定

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IPTG 體外誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDS-PAGE 分析,在68 ku 位置處出現(xiàn)表達(dá)蛋白帶,以pGEX-4T-1 表達(dá)的GST 單體蛋白約26 ku,BoAMA1 蛋白約42 ku,二者融合蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相一致(見圖5)。而未誘導(dǎo)的對(duì)照組未出現(xiàn)表達(dá)蛋白條帶。表達(dá)蛋白主要在沉淀中存在,以包涵體形式。

圖5 BoAMA1 蛋白的SDS-PAGE

2.5 表達(dá)產(chǎn)物Western Blot 分析 表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜上后,與牛卵形巴貝斯蟲陽性血清反應(yīng),在68 ku 處出現(xiàn)一條特異性目的條帶(見圖6)。表明誘導(dǎo)的蛋白可被牛卵形巴貝斯蟲陽性血清識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。

圖6 BoAMA1 蛋白的Western Blot 分析

3 討論

我國在20 世紀(jì)80 年代前,牛的巴貝斯蟲種類包括牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)[2]。白啟等從河南牛體內(nèi)分離到1 株大型巴貝斯蟲,后經(jīng)證實(shí)為卵形巴貝斯蟲(B.ovata)[3]。目前牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過臨床癥狀和血液涂片鏡檢方法,由于染色劑及相似病原體等人為因素影響鏡檢結(jié)果的判定,易出現(xiàn)誤差[4]。疫苗是防治卵形巴貝斯蟲病最為有效的方法,目前國內(nèi)尚未研制出牛卵形巴貝斯蟲病的疫苗。

AMA1 最早發(fā)現(xiàn)于諾氏瘧原蟲中,AMA1 蛋白在瘧原蟲侵染宿主細(xì)胞中是不可或缺的抗原蛋白,AMA1 是蟲體入侵紅細(xì)胞之前以膜結(jié)合形式分泌到蟲體表面蛋白[5]。范麗哲研究表明東方巴貝斯蟲AMA1 蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性[6]。國內(nèi)尚未見對(duì)卵形巴貝斯蟲AMA1 基因的研究報(bào)道。本試驗(yàn)成功克隆了卵形巴貝斯蟲AMA1 基因,其片段大小為1 042 bp,其ORF 大小為1 042 bp,編碼347 個(gè)氨基酸,分子量大小為42 ku。測(cè)序分析表明,該基因與GenBank 中登錄的卵形巴貝斯蟲的核苷酸同源性為99.8%。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示,BoAMA1 蛋白無跨膜區(qū),為膜外蛋白,因此,該蛋白可在大腸桿菌中表達(dá)。

體外誘導(dǎo)的BoAMA1 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和Western Blot 分析顯示,表達(dá)的蛋白主要存在于破碎后的沉淀中,該蛋白以包涵體存在,為不可溶性蛋白。該蛋白能被牛卵形巴貝斯蟲陽性血清識(shí)別,表明該蛋白具有較好的反應(yīng)原性,為建立特異、敏感的卵形巴貝斯蟲檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ),并為下一步開發(fā)卵形巴貝斯蟲病ELISA 診斷試劑盒提供了科學(xué)依據(jù)。