楊麗君,張 健,許嘉宇,張 璐,馮 力,陳洪巖,王玉娥

(中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室 黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150069)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病,該病在臨床上以仔豬的嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征,死亡率高達90%[1-2]。豬流行性腹瀉于1971 年在英國首次出現(xiàn),隨后許多國家相繼報道了該病的發(fā)生[3]。1976 年,我國首次報道該病的存在,而且目前該病的發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢,已成為豬產業(yè)中嚴重的傳染性疾病,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。盡管對該病的研究已有30 多年的歷史,但目前以疫苗免疫為主的防治免疫效果不佳,并且免疫失敗經(jīng)常發(fā)生[6],因此加強PEDV 與宿主相互作用的基礎研究顯得非常重要。研究表明,STAT3 通過不同的機制參與病毒的感染過程中,比如丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)和水痘帶狀皰疹病毒(Varicella Zoster virus,VZV)等[7-8]。因此本研究通過對HEK293 細胞[9]和IPEC 細胞用STAT3 特異性siRNA處理,開展對PEDV 感染和干擾素(Interferon,IFN)相關分子的研究,為進一步闡明STAT3 參與PEDV 感染引發(fā)的免疫應答機制提供了試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料 PEDV CV777 毒株、人胚腎細胞(HEK293 細胞)、豬的小腸上皮細胞(IPEC-J2 細胞)和抗PEDV N 蛋白抗體,均由本實驗室保存;Oligo d(T)18、RNA 酶抑制劑和SYBR PremixEx-TaqⅡ(2×),均購自TaKaRa 公司;MLV 反轉錄酶、RIPA裂解液,購自?；镉邢薰?RNA 提取試劑盒RNeasy Plus Mini Kit,購自QIAGEN 公司;DEPC 水,購自BIOSHARP 公司;STAT3 抗體,購自CST 公司;STAT3 特異性siRNA 和β-actin 單克隆抗體,均購自Sigma-Aldrich 公司;HRP 標記的山羊抗鼠IgG,購自中杉金橋生物技術有限公司;Super ECL 發(fā)光液,購自Thermo Scientific 公司。

1.2 引物設計 根據(jù)GenBank 中已登錄的相應的基因序列,用Oligo 7 軟件設計STAT3 和MxA,ISG15,IFN-β,IFN-λ,PEDV ORF3 以及內參β-actin 的定量引物(表1),由吉林庫美生物科技有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 敲低STAT3 對PEDV 感染影響的檢測

1.3.1 STAT3 敲低效率檢測 將對應的3 種STAT3 特異性siRNA(siSTAT3)分別轉染至HEK293 和IPEC 細胞中,于轉染后24 h,收集細胞,通過熒光定量PCR 和Western Blot 試驗方法來驗證STAT3 的敲低效率。對于熒光定量PCR 方法,按照RNA 提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)方法步驟提取總RNA,以反轉錄產物cDNA 為模板,利用引物STAT3 及內參β-actin,采用本研究室建立的熒光定量PCR 方法進行基因擴增。反應條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、55 ℃20 s、72 ℃30 s,總共40 個循環(huán),進行目的基因轉錄水平的熒光定量PCR 檢測。對于Western Blot 方法,在加入RIPA 裂解液裂解后取上清,進行SDS-PAGE 電泳,隨后將蛋白轉印至PVDF 膜上,采用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉4 ℃過夜,TBST(TBS 中含0.1% Tween-20)漂洗3 次,每次10 min;膜與相應一抗(anti-STAT3：1∶1 000,anti-β-actin：1∶10 000)室 溫孵育2 h 或4 ℃過夜,TBST 洗膜3 次;然后利用HRP 標記的山羊抗鼠mAb(1∶10 000)與PVDF 膜室溫搖床孵育1 h;再次用TBST 洗膜3 次后,加入適量super ECL 發(fā)光液后于暗室進行Western Blot 條帶檢測。

1.3.2 PEDV ORF3 的RNA 水平檢測 將對應的3種STAT3 特異性siRNA 及空白siRNA 對照分別轉染至HEK293 和IPEC 細胞中,于轉染后24 h,PEDV分別按MOI=0.1 和MOI=1 接種于這2 種細胞,37 ℃、5% CO2中分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后,收集細胞,按照RNA 提取試劑盒方法步驟提取總RNA,反轉錄,利用引物PEDV ORF3 及內參β-actin,采用熒光定量PCR 方法進行基因擴增。反應條件為：95 ℃30 s;95 ℃5 s、55 ℃20 s、72 ℃30 s,總共40 個循環(huán),進行病毒RNA 水平的熒光定量PCR檢測。

1.3.3 PEDV N 蛋白水平檢測 將對應的3 種STAT3 特異性siRNA 分別轉染至HEK293 和IPEC細胞中,于轉染后24 h,PEDV 分別按MOI=0.1 和MOI=1 接種于這2 種細胞,37 ℃、5% CO2中分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后,收集細胞裂解后取上清,進行SDS-PAGE 電泳,轉膜,4 ℃封閉過夜,膜與相應一抗(anti-PEDV N：1∶1000,anti-β-actin：1∶10 000)室溫孵育2 h 或4 ℃過夜,然后利用HRP 標記的山羊抗鼠mAb(1∶10 000)與PVDF 膜室溫搖床孵育1 h,加入適量super ECL 發(fā)光液后于暗室進行Western Blot鑒定。

1.4 STAT3 對IFN 相關基因影響的檢測 將3 種STAT3 特異性siRNA 混合后轉染至HEK293 和IPEC-J2 細胞中,同時siRNA 空白組作為對照,于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h,收集細胞后直接按照RNA 提取試劑盒的方法步驟提取總RNA,以Oligo d(T)18為引物反轉錄獲得cDNA,以其為模板,利用引物MxA,ISG15,IFN-β和IFN-λ,采用熒光定量PCR 方法進行基因擴增。反應條件為：95 ℃30 s;95 ℃5 s、58 ℃20 s、72 ℃30 s,總共40 個循環(huán),進行相關基因轉錄水平的熒光定量PCR 檢測。

2 結果

2.1 敲低STAT3 對PEDV 感染的影響2.1.1 STAT3 敲低效率檢測結果 將STAT3 特異性siRNA 轉染24 h 后的HEK293 和IPEC-J2 細胞收集后利用熒光定量PCR 和Western Blot 方法進行STAT3 敲低處理后的RNA 水平和蛋白水平的檢測,結果發(fā)現(xiàn),與siRNA 空白對照組相比,特異性siRNA轉染組中STAT3 目的基因RNA 水平(圖1A,1C)和蛋白水平(圖1B,1D)顯著降低(P＜0.05),表明該siRNA 是有效果的,可以用于后續(xù)試驗。

圖1 熒光定量PCR 和Western Blot 檢測STAT3 敲低效率

2.1.2 PEDV ORF3 的RNA 水平檢測結果 將MOI=0.1 和MOI=1 的PEDV 分別接種于STAT3特異性siRNA 轉染24 h 后的HEK293 和IPEC-J2 細胞中,分別感染24 h 和48 h 后收集細胞提取總RNA,利用熒光定量PCR 方法進行病毒RNA 水平的檢測。檢測結果顯示,與siRNA 空白對照組相比,STAT3 siRNA 轉染組PEDV ORF3 的RNA 水平顯著降低(P＜0.05)(圖2)。表明在HEK293 和IPEC-J2 細胞中,降低STAT3 內源性表達能夠顯著抑制PEDV 的感染。

2.1.3 PEDV N 蛋白水平檢測結果 將MOI=0.1和MOI=1 的PEDV 分別接種于STAT3 特異性siRNA 轉染24 h 后的HEK293 和IPEC-J2 細胞中,分別感染24 h 和48 h 后收集細胞裂解后取上清,經(jīng)SDS-PAGE 后轉印至PVDF 膜,Western Blot 檢測結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,敲低STAT3 后PEDV N 蛋白表達量明顯降低(圖3)。表明在HEK293 和IPEC-J2細胞中,敲低STAT3 能夠顯著抑制PEDV 的復制。

圖2 熒光定量PCR 檢測PEDV ORF3 的RNA 水平

圖3 Western Blot 鑒定敲低STAT3 對PEDV 的影響

2.2 STAT3 對IFN 相關基因的影響檢測結果 為進一步研究STAT3 的作用機制,將三個STAT3 特異性siRNA 混合后轉染至HEK293 和IPEC-J2 細胞中,同時siRNA 空白作為對照,利用熒光定量PCR 方法測定目的基因的變化情況。結果顯示,與空白對照組相比,在HEK293 和IPEC-J2 細胞中,敲低內源性STAT3 表達水平后可以明顯促進MxA,ISG15,IFN-β以及IFN-λ的mRNA 水平(P＜0.05)(圖4)。表明在HEK293 和IPEC-J2 細胞中,STAT3 負調控IFN抗病毒活性。

圖4 熒光定量PCR 檢測MxA, ISG15, IFN-β 和IFN-λ 的mRNA 水平

3 討論

干擾素是先天性免疫的重要組成部分,病毒感染細胞會分泌大量的Ⅰ型干擾素(IFN-I),當IFN-I作用于其他細胞時產生抗病毒蛋白從而抵抗病毒的感染。IFN-I 與其受體結合后會激活STAT 蛋白,包括STAT1,STAT2 和STAT3。雖然已經(jīng)有大量文獻表明STAT1 和STAT2 參與到I 型干擾素抗病毒反應中,但是STAT3 在該反應中的作用卻不明確。近年來,有研究表明,HCV 感染過程中STAT3 會發(fā)生磷酸化,促進HCV 的感染[7];在人胚胎肺成纖維細胞中過表達STAT3,能夠明顯抑制IFN-I 對VZV感染引起的抑制作用,促進VZV 復制[8];當STAT3沉默時會抑制病毒復制,即STAT3 負調控IFN-I 的信號轉導作用[10];在小鼠胚胎成纖維細胞和骨髓巨噬細胞中也發(fā)現(xiàn)STAT3 蛋白對IFN 及其下游基因起負調節(jié)作用[11];而在新型腸道病毒71 型(EV71)感染時可以明顯抑制STAT3 發(fā)生磷酸化,活化的磷酸化的STAT3 可抑制病毒復制,即敲低STAT3 蛋白可以促進病毒復制,提高STAT3 表達量則抑制病毒感染[12]。這也表明STAT3 蛋白影響病毒復制的過程是一種對病毒特異性的應答過程。本研究的試驗結果表明,在降低STAT3 蛋白的內源性表達時接種PEDV,通過蛋白水平和mRNA 水平檢測證明,STAT3 表達量降低可以明顯抑制病毒在細胞內的復制;進一步探究發(fā)現(xiàn)STAT3 siRNA 轉染組能夠顯著升高IFN 相關基因MxA,ISG15,IFN-β以及IFN-λ的mRNA 水平。本研究對于進一步闡明STAT3 參與PEDV 感染引發(fā)的免疫應答機制提供了試驗依據(jù)。