張夢(mèng)圓,吾力江,姜 媛,宋晶晶,王盼舉,聞秀秀,王莉君,巴音查汗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊830052;2.新疆哈密市伊吾縣畜牧局畜牧工作站,新疆 烏魯木齊 839200)

駑巴貝斯蟲病是由駑巴貝斯蟲寄生于馬、騾、驢等馬屬動(dòng)物體內(nèi)的蜱傳血液原蟲病[1]。其蟲體大于紅細(xì)胞半徑,該病的臨床癥狀呈現(xiàn)稽留熱型、貧血、黃疸、血紅蛋白尿,部分急性病例會(huì)導(dǎo)致死亡。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B 類疫病,我國(guó)將其列為二類疫病,該病呈全球性分布流行,具有很明顯的季節(jié)性,無(wú)周期性,且熱帶、亞熱帶地區(qū)居多,巴西、南非、土耳其等國(guó)均有報(bào)道;我國(guó)新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、吉林、廣州等地均存在馬駑巴貝斯蟲病相關(guān)報(bào)道[2]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道共有3 屬14種的媒介蜱傳播該病,其中我國(guó)已查明可以傳播馬駑巴貝斯蟲的媒介蜱包括草原革蜱、銀盾革蜱、中華革蜱[3];銀盾革蜱是新疆駑巴貝斯蟲的傳播者。馬屬動(dòng)物被攜帶有病原的媒介蜱叮咬后,駑巴貝斯蟲隨蜱蟲唾液進(jìn)入馬屬動(dòng)物血液內(nèi),寄生于馬屬動(dòng)物的紅細(xì)胞內(nèi)[4]。亞急性、慢性病例終身成為帶蟲宿主[5]。近年來(lái)新疆馬產(chǎn)業(yè)日益發(fā)展,隨著馬屬動(dòng)物調(diào)用、運(yùn)輸?shù)念l繁,馬駑巴貝斯蟲病的感染也不斷增加,嚴(yán)重影響和制約著馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

為了解新疆部分地區(qū)馬匹感染馬駑巴貝斯蟲病情況,本試驗(yàn)針對(duì)馬主產(chǎn)區(qū)采集樣品,通過(guò)PCR[6-7]方法對(duì)所采集的樣品DNA 進(jìn)行病原檢測(cè),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異情況分析,以便了解新疆馬駑巴貝斯蟲病的重疫區(qū)、威脅區(qū)、疑似區(qū)分布狀況和對(duì)新疆馬產(chǎn)業(yè)的危害程度,為該病的綜合防制奠定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存 2016 年3-4 月和2017年4-5 月在北疆伊犁昭蘇種馬場(chǎng)、阿勒泰和吐魯番托克遜分別采集165 份、58 份和11 份血液,在南疆巴音布魯克牧場(chǎng)、和靜分別采集72 份和198 份血液,共計(jì)504 份。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 樹脂型TM 基因組DNA 提取試劑盒,購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;PCR 擴(kuò)增試劑,購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;T100TMThmal Cycler PCR 儀、Gel Doc 2000 紫外凝膠成像系統(tǒng),購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬駑巴貝斯蟲全基因組核酸的提取 嚴(yán)格參照全基因組DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明書提取DNA,-20 ℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

1.3.2 PCR 目的片段的擴(kuò)增及序列比對(duì)分析 以提取的血液基因組DNA 為模板,參照瓦熱斯等[6]擴(kuò)增馬駑巴貝斯BC48 基因的目的片段合成,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。馬駑巴貝斯蟲引物：

BC48-F：5′-GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG-3′,BC48-R：5′-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3′,擴(kuò)增特異性片段長(zhǎng)為452 bp。采用13 μL 反應(yīng)體系以全血基因組DNA 為模板,Mix 6.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,滅菌去離子水加2.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;56 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min;35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品DNA 由寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將檢測(cè)的陽(yáng)性樣品DNA 為模板,Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,DNA 模板3 μL,滅菌去離子水至50 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化目的片段,與pEASY-T1 Cloning Kit 載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16 h,挑單菌落于含氨芐青霉素5 mL LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),菌落PCR 檢測(cè),陽(yáng)性質(zhì)粒送昆泰銳生物工程股份有限公司測(cè)序。序列經(jīng)NCBI(BLAST)和GENETYX 軟件比對(duì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析 運(yùn)用SPSS 19.0 軟件對(duì)不同地區(qū)不同年齡段馬感染馬駑巴貝斯蟲情況進(jìn)行單因素方差分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR 方法擴(kuò)增馬駑巴貝斯蟲結(jié)果 對(duì)馬血液基因組DNA 進(jìn)行馬駑巴貝斯BC48 基因擴(kuò)增,采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,獲得452 bp 的目的條帶,與預(yù)期片段大小相符,見圖1。

圖1 南北疆部分馬駑巴貝斯蟲BC-48 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 序列分析結(jié)果 測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI(BLAST)和GENETYX 軟件進(jìn)行序列比對(duì),擴(kuò)增結(jié)果與3 個(gè)已知的駑巴貝斯蟲BC 48 基因序列比對(duì),結(jié)果表明與JN217099.1 和KY111763.2 有3 個(gè)堿基不同,同源性為99%;與KY111764.2 有4 個(gè)堿基不同,同源性為99%,見圖2。

圖2 駑巴貝斯蟲BC 48 基因序列與已知序列比對(duì)分析

2.3 南北疆不同地區(qū)馬駑巴貝斯蟲感染結(jié)果 對(duì)北疆昭蘇種馬場(chǎng)、阿勒泰和吐魯番托克遜以及南疆和靜和巴音布魯克牧場(chǎng)所采集的樣品經(jīng)PCR 檢測(cè),結(jié)果表明,所檢測(cè)的504 份馬血液中有54 份為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為10.71%(54/504)。其中北疆昭蘇種馬場(chǎng)、阿勒泰、吐魯番托克遜馬駑巴貝斯蟲陽(yáng)性率分別為20.61%(34/165)、5.17%(3/58)、0(0/11);南疆巴音布魯克牧場(chǎng)、和靜馬駑巴貝斯蟲陽(yáng)性率分別為0(0/72)、8.59%(17/198)。

2.4 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲感染結(jié)果 對(duì)X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9 四個(gè)年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況進(jìn)行檢測(cè),4 個(gè)年齡段馬駑巴貝斯蟲感染率分別為9.76%、10.53%、11.21%和11.65%,見表1。

表1 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.5 不同地區(qū)馬感染馬駑巴貝斯蟲情況單因素方差分析 針對(duì)北疆、南疆部分地區(qū)馬匹感染馬駑巴貝斯蟲情況使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示,昭蘇種馬場(chǎng)與阿勒泰和巴音布克牧場(chǎng)存在極顯著性差異(P＜0.01);巴音布魯克牧場(chǎng)與和靜之間存在極顯著性差異(P＜0.01);昭蘇種馬場(chǎng)與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05),其余各地方差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況單因素方差分析 本次試驗(yàn)對(duì)樣品采集地區(qū)的不同年齡段(X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9)馬駑巴貝斯蟲感染情況使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果表明,各個(gè)年齡段馬駑巴貝斯蟲感染無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論與小結(jié)

目前,國(guó)內(nèi)對(duì)馬駑巴貝斯蟲病的診斷通常使用血液涂片、PCR、ELISA 等常規(guī)的檢測(cè)方法。血液涂片鏡檢法手段操作簡(jiǎn)便直接,然而其針對(duì)涂片人員和涂片技術(shù)要求較高,染蟲率低時(shí),漏檢的可能性大;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在檢出帶蟲宿主[4]上是最好的一種血清學(xué)檢測(cè)方法;針對(duì)潛伏期和隱性感染階段,PCR 檢測(cè)方法應(yīng)用普遍,敏感性、特異性較高,在基層檢測(cè)工作中,PCR 的方法更容易掌握和操作,結(jié)果可靠,易于推廣[7]。

本試驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)北疆昭蘇種馬場(chǎng)、阿勒泰和吐魯番托克遜以及南疆和靜和巴音布魯克牧場(chǎng)所采集的樣品用PCR 方法對(duì)馬駑巴貝斯蟲病原DNA 進(jìn)行了檢測(cè),并分析了不同地區(qū)、不同年齡段利用PCR 對(duì)馬駑巴貝斯蟲檢測(cè)結(jié)果,以期為不同疫區(qū)的放牧馬駑巴貝斯蟲病綜合防治奠定基礎(chǔ)。

馬駑巴貝斯蟲病在不同地區(qū)的流行情況均存在差異,這與當(dāng)?shù)厮拗黢R的分布、媒介蜱的出沒規(guī)律、流行因素等3 個(gè)環(huán)節(jié)有密切關(guān)系。在5 個(gè)不同的地區(qū)用PCR 方法的檢測(cè)結(jié)果中,北疆昭蘇種馬場(chǎng)馬駑巴貝斯蟲的陽(yáng)性較高為20.61%(34/165),南疆和靜地區(qū)馬駑巴貝斯蟲陽(yáng)性率8.59%(17/198)。與Xuenan Xuana[8]所分析的新疆本地馬駑巴貝斯蟲感染率為2.2%～38.7%結(jié)果一致。其中吐魯番托克遜牧場(chǎng)和巴音布魯克牧場(chǎng)的陽(yáng)性率為0。經(jīng)單因素方差分析后,發(fā)現(xiàn)昭蘇種馬場(chǎng)與阿勒泰和巴音布克牧場(chǎng)分別存在極顯著性差異(P＜0.01);巴音布魯克牧場(chǎng)與和靜也存在極顯著性差異(P＜0.01);昭蘇種馬場(chǎng)與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05),其余各地方差異不顯著。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于北疆昭蘇地處北疆伊犁河谷,氣候濕潤(rùn),植被豐富,馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)模較大。南疆和靜地區(qū)春季冷暖空氣交替頻繁并且多大風(fēng)天氣,昭蘇地區(qū)的地理環(huán)境與和靜地區(qū)的氣候環(huán)境給蜱蟲孳生提供便利,而阿勒泰地區(qū)春季融雪較晚,巴音布魯克牧場(chǎng)地理位置獨(dú)特,分布著高寒草原,氣溫相對(duì)較低,不利于蜱蟲孳生。同時(shí)南北疆蜱種也存在很大的差異性。昭蘇種馬場(chǎng)與阿勒泰,巴音布克牧場(chǎng);巴音布魯克牧場(chǎng)與和靜分別存在極顯著性差異(P＜0.01);吐魯番托克遜地區(qū)氣候干燥可能制約了蜱蟲的繁殖。所以,昭蘇種馬場(chǎng)與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05)。此外,吐魯番托克遜、阿勒泰、巴音布魯克牧場(chǎng)、和靜這幾個(gè)調(diào)查區(qū)域在地理位置上相互接近,地理環(huán)境相差不大,故馬駑巴貝斯蟲的感染率差異不顯著。馬駑巴貝斯蟲在新疆的總體感染情況呈北疆高于南疆,并且存有地方差異,這種分布特點(diǎn)將對(duì)其流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義,同時(shí)可為該病的監(jiān)控提供方向。

參照朱玉濤,李永暢[9-10]年齡段劃分,并依據(jù)當(dāng)?shù)啬撩穹拍燎闆r,對(duì)各地區(qū)的樣品進(jìn)行年齡段劃分。在不同年齡段PCR 檢測(cè)結(jié)果中,4 個(gè)年齡段馬駑巴貝斯蟲感染率分別為9.76%、10.53%、11.21%和11.65%。X≤3 年齡段的感染情況低于其他年齡段,這可能與馬匹未接觸傳播蜱或自身免疫等原因有關(guān)。對(duì)4 個(gè)年齡段進(jìn)行單因素方差分析后,發(fā)現(xiàn)各個(gè)年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況無(wú)顯著性差異。此結(jié)果與李永暢[10]所分析的結(jié)果一致。