尤 勇，張北源，陳顯成，錢雅君，陳 鳴，虞竹溪，虞文魁

0 引 言

心搏驟停后39.8%～43%的患者存在急性腎損傷，心搏驟停后急性腎損傷的發(fā)生與高病死率密切相關［1-2］，保護心搏驟停后腎功能顯得尤為重要。亞低溫治療是心臟驟停后腦保護的重要措施，也是研究者關注的熱點。然而，亞低溫對于心肺復蘇后腎功能的保護作用和機制仍是不確定的［3］。目前關于亞低溫對心搏驟停后腎保護作用的研究甚少，少量的文獻報道亞低溫可能減少腎缺血損傷，對腎功能有保護作用，但存在爭議［4-5］。我們設計了這個動物實驗，首先在于觀察亞低溫對心肺復蘇后豬腎的保護作用，并探索其中機制。在亞低溫維持階段的24～48 h里，由于臨床醫(yī)師采取的降溫措施的局限性（特別是采取藥物降溫和體表降溫方法的患者），以及臨床關注度和細節(jié)處理的差異，實際上患者往往難以保持相對穩(wěn)定的目標體溫，在亞低溫維持階段患者體溫大幅波動比較常見，這是否會影響亞低溫治療效果，目前尚未可知。文獻報道，在亞低溫治療結束后，過快復溫帶來的溫度波動導致炎癥反應放大，對機體器官帶來嚴重的二次損傷［6］，可能會因此削弱亞低溫治療的器官保護效果。我們推測，在亞低溫維持階段，異常的體溫波動同樣會影響亞低溫的治療效果。故本研究還旨在比較波動亞低溫和恒定亞低溫對心肺復蘇后豬腎的保護作用是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組健康實驗用豬18 只，由南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2014-0051，體重50～55 kg。采用隨機數(shù)字表法將其分為3 組：恒溫組、變溫組和對照組，每組6只。

1.2 麻醉與監(jiān)護實驗前禁食24 h，不禁水。開放耳緣靜脈，采用氯胺酮20 mg/kg注射進行誘導麻醉，丙泊酚4～6 mg/（kg·h）、芬太尼2 μg/（kg·h）持續(xù)泵入維持麻醉。經(jīng)口氣管插管接呼吸機（Evita XL，Drager，德國）輔助呼吸，模式為容量控制同步間歇指令通氣（V-SIMV），參數(shù)：FiO250%，Vt 8 mL/kg，PEEP 5 cmH2O（1 cmH20=0.098 kPa），I∶E=1∶1.5，心率15 次/min。連接心電監(jiān)護儀，舌尖監(jiān)測外周血氧飽和度。床旁超聲引導下于左側股動脈置入PICCO動脈測壓導管（4F，PV2014L16，Pulsion Medical System，德國），實時監(jiān)測動脈血壓及血溫，左頸內靜脈置入雙腔深靜脈導管（7F，CVC-2，F(xiàn)ORNIA，中國）用于補液及給藥。復方氯化鈉注射液、5%葡萄糖氯化鈉注射液10～15 mL/（kg·h）交替持續(xù)靜脈補液。

1.3 體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)準備 ECMO 管路預充：0.9%等滲鹽水注射液充分排氣，羥乙基淀粉200/0.5 氯化鈉注射液500 mL預充管路，預充液中加入肝素鈉注射液25 mg。ECMO 導管置入：實驗動物頸部及腹股溝備皮，充分消毒，床旁超聲定位穿刺血管，經(jīng)皮穿刺，放置導絲，沿導絲逐級擴張，分別放置14 Fr頸內靜脈，8 Fr股動脈插管，經(jīng)超聲定位證實導管分別達到右房、髂動脈處，管道鉗夾閉，靜脈推注1mg/kg肝素鈉注射液預抗凝，絲線縫扎固定。

1.4 心跳驟停模型建立與體外心肺復蘇（extracorporeal ardiopulmonary resuscitation,ECPR）停止機械通氣，經(jīng)胸壁以36 V 交流電進行電擊，持續(xù)時間30 s，必要時重復，直至ECG 呈室顫波形，ABP波形消失，數(shù)值為0，持續(xù)8 min 后開始進行心肺復蘇，持續(xù)胸外按壓，并實施非同步直流電擊除顫（150～200 J），恢復機械通氣（FiO2100%，余參數(shù)同前）。胸外按壓頻率至少100 次/min，按壓深度為胸廓前后徑1/3，期間間斷給予腎上腺素、碳酸氫鈉及阿托品，直至心搏恢復，重新建立循環(huán)。心肺復蘇開始后，將實驗動物動靜脈管路分別連接預充好的ECMO 管路，ECMO 轉速調整為2000～2500 轉/min，流量控制為20～40 mL/（kg·min），氧流量調整為1.0～1.5 mL/min。應用去甲腎上腺素維持平均動脈壓＞65 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并適當補充復方氯化鈉、羥乙基淀粉及調整電解質、酸堿平衡。在ECMO 運轉過程中持續(xù)靜脈泵入肝素鈉抗凝，根據(jù)ACT及有無出血傾向調整肝素速率。

1.5 體溫管理恒溫組將ECMO 水浴箱溫度調整至34℃，變溫組則每2小時調節(jié)水浴箱溫度，讓動物體溫波動于33～35 ℃。對照組將ECMO 水浴箱溫度調整至37℃。恒溫組和的變溫組動物維持亞低溫治療24 h 后予以復溫，復溫速度控制在每2 小時升高≤1℃，直至血溫達37 ℃。

1.6 標本收集與觀察方法復溫結束后，全麻下打開腹腔切取右腎，取右腎皮髓交界處數(shù)小塊標本，分別置于10%福爾馬林和液氮凍存管保存。實驗結束后按倫理規(guī)定處死動物。

1.6.1 實時熒光定量PCR測定凋亡基因BAX、Bcl-2、GRP78、CHOP蛋白的表達。腎組織mRNA的提取和逆轉錄均按照說明書進行。實時熒光定量PCR反應體系為2×qPCR Mix12.5 μL、7.5 μmol/L 基因引物2.0μL、反轉錄產(chǎn)物2.5μL、ddH2O 8.0μL。PCR擴增：預變性95 ℃10 min；變性95 ℃15 s，60℃退火60 s，循環(huán)40次；熔解曲線60→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。結果處理ΔΔCT法，目的基因相對表達量=2-ΔΔCT。

ΔΔCT=［CT（目的基因，待測樣本）-CT（內標基因，待測樣本）］-［CT（目的基因，對照樣本）-CT（內標基因，對照樣本）］

引物序列：Bax：上游5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下 游 上 游5′-TGCCGTCAGCAAACATTTCG-3′；Bcl-2：上 游5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCGG-3′，下 游 上 游5′-CCATACAGCTCCACAAAGGCAT-3′；GRP78：上 游 5′-GTTCCTGCCTTTCAAGGTGGTT-3′， 下 游 上 游 5′-TTCCCAAATAAGCCTCAGCAGTT-3′；CHOP：上 游5′-AGTCATTGCCTTTCTCCTTCGG-3′，下游上游5′-GGTCTTCTTTGGTCTTCCTCCTCT-3′；Gapdh：上 游5′-GTGAAGGTCGGAGTGAACGGA-3′，下游上游5′-CCATTTGATGTTGGCGGGAT-3′。

1.6.2 免疫組織化學檢測將石蠟切片進行脫蠟水化，置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，放入3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。在組化圈內滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。加入一抗4 ℃過夜，自然恢復至室溫，再加入二抗，室溫孵育50 min。滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木精復染3 min 左右，自來水洗，蘇木精分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木精返藍液返藍，流水沖洗，脫水封固。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。結果判定：蘇木精染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

1.6.3 組織病理學檢查取豬腎組織置于2.5%戊二醛溶液中固定24 h，經(jīng)漂洗、再固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片后裝上銅載網(wǎng)格，行鉛鈾雙染，置于透射電鏡下觀察超微結構并拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析應用SPSS 22. 0 軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，進行正態(tài)性檢驗，如果資料符合正態(tài)分布，則選用方差分析，如果不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 動物模型制作18 只實驗用豬均制作成電擊后心跳驟停模型，并全部成功實施體外心肺復蘇術，復蘇成功率100%。平均復蘇時間為（6.3±2.9）min，3組間復蘇時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 實時定量PCR 結果與常溫組比較，變溫組、恒溫組中腎組織中GRP78、CHOP 表達均降低、Bcl-2 表達升高（P＜0.05），恒溫組Bax 表達降低（P＜0.05）；與變溫組比較，恒溫組Bcl-2表達升高，GRP78表達降低（P＜0.05）。見表1。

表1 RT-PCR 檢測凋亡相關基因熒光實時PCR 表達倍數(shù)（±s）Table 1 The expression of apoptosis related genes after quantitative RT-PCR（xˉ±s）

表1 RT-PCR 檢測凋亡相關基因熒光實時PCR 表達倍數(shù)（±s）Table 1 The expression of apoptosis related genes after quantitative RT-PCR（xˉ±s）

與常溫組比較，*P＜0.05，與變溫組比較，#P＜0.05

組別常溫組變溫組恒溫組n666 Bax 2.00±0.57 1.79±0.60 1.05±0.29*Bcl-2 1.03±0.20 1.65±0.34*2.42±0.64*#GRP78 0.59±0.11 0.42±0.14*0.22±0.08*#CHOP 2.51±0.42 1.84±0.49*1.30±0.59*

2.3 免疫組化結果光鏡下觀察免疫組織化學切片，結果顯示：常溫組豬腎組織Bax 呈強陽性表達，變溫組Bax 陽性表達減弱，恒溫組僅少量Bax 呈弱陽性表達；恒溫組Bcl-2 陽性表達最為顯著，Bcl-2 陽性表達在常溫組最少。見圖1。

2.4 透射電子顯微鏡常溫組豬腎表現(xiàn)為核膜皺縮，核仁縮小，細胞核內染色質高度盤繞，細胞質中可見線粒體明顯腫脹，脊結構消失，產(chǎn)生空泡樣改變。變溫組較常溫組損傷程度減輕，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)核膜皺縮，核染色質濃聚致密，染色質邊集成環(huán)形，出現(xiàn)許多空泡結構。恒溫組損傷程度最輕，多數(shù)細胞形態(tài)學變化不明顯，細胞核位于細胞中部，核膜形態(tài)完整，染色質分布較均勻，細胞質內見正常線粒體等細胞器。見圖2。

圖1 鏡下觀察豬腎組織Bax、Bcl-2細胞形態(tài)（免疫組化染色×200）Figure 1 Immunohistochemical DAB staining of Bcl-2 in swine renal tissue（IHC×200）

圖2 豬右腎皮髓交界處組織電鏡觀察結果（×3000）Figure 2 The results of the transmission electron microscopy of the right renal cortex medullary junction in swines（×3000）

3 討 論

一直以來，心跳驟停大動物模型面臨著復蘇成功率低、復蘇后并發(fā)癥多、個體原發(fā)性損傷差異大等困難，導致研究基線難以匹配一致，研究結論備受爭議。本研究采用了體外心肺復蘇的方式，在開始常規(guī)心肺復蘇的同時，運行體外膜肺支持，大大提高了動物模型心肺復蘇的成功率［7］，最大限度地降低復蘇后血流動力學紊亂的個體差異，減輕研究結果偏移。另外，體外膜肺的控溫系統(tǒng)用于亞低溫治療期間的體溫管理，易于監(jiān)控和調節(jié)，能夠達到可靠穩(wěn)定的降溫目標。這一動物模型的缺陷在于高成本和高技術要求。

心搏驟停在經(jīng)過成功的心肺復蘇后恢復自主循環(huán)，機體各重要器官在經(jīng)過長時間、完全的缺血之后面臨缺血-再灌注損傷的二次打擊，包括鈣超載、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等多種機制參與腎缺血-再灌注損傷的病理生理過程［3］。研究發(fā)現(xiàn)，腎缺血-再灌注過程中，腎皮髓質交界區(qū)腎小管細胞發(fā)生凋亡，72h后出現(xiàn)特征性凋亡小體［8］。目前觀點認為腎小管細胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)之一，是導致缺血再灌注后腎功能障礙的重要因素［10］。亞低溫是心肺復蘇后神經(jīng)保護的重要治療措施，近年來，亞低溫對組織缺血缺氧的保護作用越來越受到學者們的關注，其對凋亡信號通路的抑制是亞低溫神經(jīng)保護作用的機制之一［10］，研究發(fā)現(xiàn)亞低溫可以降低促凋亡蛋白Bax 的表達，明顯減少缺血再灌注后凋亡神經(jīng)元數(shù)量［11］。但是亞低溫對于缺血再灌注后腎的作用目前知之甚少。有小樣本臨床研究顯示，亞低溫可能通過降低代謝和氧耗保護心肺復蘇后腎功能［6］，但存在很多爭議［12-13］。本研究通過觀察ECPR 后豬腎組織形態(tài)學，發(fā)現(xiàn)亞低溫（包括恒定亞低溫和波動亞低溫）能夠顯著減輕腎缺血再灌注損傷，減少腎組織內凋亡細胞數(shù)量，結合ECPR 后豬腎組織中調控細胞凋亡相關蛋白（Bcl-2、Bax、GRP-78、CHOP）表達情況，認為亞低溫可以減輕心肺復蘇后腎損傷，可能與其降低缺血再灌注所致的內質網(wǎng)應激，從而下調腎小管細胞凋亡有關。

目前臨床有多種措施用于誘導和維持亞低溫，常用的降溫措施包括藥物降溫、體表降溫和核心降溫。藥物降溫通常選擇肌松藥聯(lián)合冬眠合劑，可配合靜脈輸注冷鹽水。體表降溫包含擦浴、外部水循環(huán)降溫毯、凝膠涂層降溫毯等，核心降溫主要是血管內球囊冷卻系統(tǒng)、各體腔（腹腔、胸腔、胃腸道等）灌注等。目前臨床上常用的各種降溫措施在亞低溫誘導階段的作用基本可靠，但在維持階段對體溫的控制均不穩(wěn)定［14］，可能會導致體溫波動不定，而且難以調整，這在臨床上十分常見。已有研究表明在復溫階段，體溫上升速度需要嚴格控制，否則影響亞低溫對器官功能的保護作用，甚至可能損傷腎功能［6］，說明體溫波動對患者影響之大。但是在亞低溫維持階段，溫度的波動會對器官功能造成什么影響，目前尚無報道。本研究在亞低溫維持階段，模擬臨床上體溫控制不穩(wěn)定的現(xiàn)象設置變溫組，每2小時調節(jié)水浴箱溫度，讓動物模型體溫波動于33～35 ℃之間。研究結果揭示，變溫組動物模型腎小管細胞凋亡程度較恒溫組嚴重，亞低溫維持階段的異常體溫波動通過調節(jié)內質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡途徑影響亞低溫治療效果。目前尚無研究報道在亞低溫維持階段體溫的異常波動對臟器功能造成何種影響，本實驗結果首次揭示，亞低溫維持階段體溫的異常波動造成腎小管細胞凋亡增加，削弱了亞低溫對豬腎的保護作用，維持恒定亞低溫對于保護心肺復蘇后腎功能非常重要。

綜上所述，恒定亞低溫通過抑制心肺復蘇后豬腎小管細胞內質網(wǎng)應激，減輕腎小管細胞凋亡，起到腎保護作用；亞低溫維持階段的體溫異常波動可能削弱亞低溫對腎的保護作用。