顏瑩瑩，朱旭輝，胡南南，劉 源，朱 進(jìn)，金 柯，韓亞萍，李 軍

0 引 言

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是一種新型的傳染病，由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）引起［1］。SFTS 的主要臨床表現(xiàn)包括急性發(fā)熱（≥38 ℃）、血小板減少、白細(xì)胞減少、胃腸道癥狀等，重癥患者會(huì)出現(xiàn)多器官功能衰竭［2-3］。目前，我國該病的病死率為6%～30%［4］。

SFTS 的傳播主要是通過蜱蟲叮咬［7］，另有研究證實(shí)SFTS 也可以通過與受感染者的血液或分泌物密切接觸而發(fā)生［5-6］。而且，人群對(duì)SFTSV 普遍易感。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心的報(bào)道，我國共有23個(gè)省市報(bào)告SFTS病例［7］；日本、韓國、朝鮮、美國、印度也有類似病例［8-10］。相關(guān)報(bào)道顯示，該病發(fā)病有逐年升高的趨勢(shì)［4］。由此可見，SFTS 流行地域廣并且人群普遍易感，值得我們進(jìn)一步研究。

既往研究結(jié)果顯示SFTS 患者血清中干擾素-α（interferon-α，IFN-α）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）IL-10、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-inducible protein-10，IP-10）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等因子的表達(dá)水平明顯高于健康人；此外，重癥患者血清中IFN-α、IFN-γ、G-CSF、MIP-1α、IL-6 和IP-10表達(dá)水平明顯高于輕癥患者［11-13］，由此可見炎性因子的分泌水平與SFTS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。其中，TNF-α、IL-6 和MCP-1 等促炎因子的合成主要依賴核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）/Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號(hào)通路［14］，SFTSV 感染單核細(xì)胞后會(huì)引起NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控失衡進(jìn)而導(dǎo)致炎性因子分泌的紊亂。有研究顯示，SFTS嚴(yán)重程度與患者骨髓樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞中Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）表達(dá)降低相關(guān)［15］。但目前，尚未確定機(jī)體免疫系統(tǒng)尤其是巨噬細(xì)胞、TLR是如何參與SFTSV的識(shí)別，以及如何引起炎性因子風(fēng)暴的。

本研究旨在探索SFTSV 感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后TLR2 和炎性因子表達(dá)水平的改變情況，從而為進(jìn)一步闡明炎性因子在SFTSV 感染致病中的作用及其機(jī)制提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑SFTSV JS14 株由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供。非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero 細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；RNA 提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；cDNA 合成試劑盒、SYBR green 試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。TNFα、IL-6 和IL-10 炎性因子檢測(cè)試劑盒購自Multisciences 公司，IFN-β 試劑盒購自Elabscience 公司。熒光定量PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 的引物序列如下，TLR2 上游引物（5′-ATCCTCCAATCAGGCTTCTCT-3′），下游引物（5′-GGACAGGTCAAGGCTTTTTACA-3′）；TNF-α 上 游引物（5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′），下游引物（5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3′）；IFN-β上游引物（5′-CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC-3′），下游引物（5′-GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT-3′）；IL-6上游引物（5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′），下游引物（5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′）；IL-10 上游引物（5′-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3′），下游引物（5′-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3′）；β-actin 上游引物（5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′），下游引物（5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′）。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗TLR2 單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司。Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）用于檢測(cè)Western條帶信號(hào)。

1.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集與提取選6～8 周齡的C57BL/6J 小鼠，腹腔注射4%巰乙基淀粉肉湯3 mL/只，3 d 后脫頸處死，用RPMI-1640 培養(yǎng)基沖洗腹腔，重懸離心后計(jì)數(shù)鋪板，24 孔板3×105個(gè)/孔，6 孔板1.5×106個(gè)/孔。細(xì)胞培養(yǎng)選用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3 h 后換液去除未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）代表了感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MOI=0.5、MOI=1 和MOI=2的SFTSV 均可誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，且細(xì)胞因子的表達(dá)水平在MOI=2 時(shí)最高。為更好地觀察病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)炎性因子水平的變化，隨后用MOI=2 的SFTSV 量感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.3 SFTSV 接種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞取SFTSV 接種每孔細(xì)胞，感染后0、6、12、24、36、48、72 h 收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清，一部分細(xì)胞用于熒光定量PCR 檢測(cè)TLR2和細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，另一部分細(xì)胞用于Western blot 檢測(cè)TLR2 蛋白表達(dá)；培養(yǎng)上清用于ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.4 熒光定量PCR 檢測(cè)用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，2h 后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收集SFTSV感染后第0、6、12、24、36、48、72 小時(shí)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 用作熒光定量PCR 模 板，在LightCycler 2.0（Roche Diagnostics，CA，USA）上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后以目的基因的CT 值減去內(nèi)參β-actin 的CT 值為△CT，以2-△△CT方法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot 法檢測(cè)用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，2 h 后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；分別在感染后6、12、24、36、48 和72 h 收集細(xì)胞，細(xì)胞先用無菌預(yù)冷PBS 洗2 次，吸棄PBS，加入細(xì)胞裂解液、磷酸酶和蛋白酶抑制劑，充分裂解混勻，冰上靜置30 min；4℃，12 000×g 離心10 min，吸取上清用BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。40 μg 總蛋白上樣跑膠結(jié)束后，恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜約1 h，5%脫脂奶中封閉37 ℃1 h，加入抗TLR2 單克隆抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，室溫孵育羊抗兔二抗1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。NC膜于室溫下ECL顯色。

1.6 ELISA 法檢測(cè)用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，2 h 后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；分別收集感染后0、6、12、24、36、48 和72 h 的細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的表達(dá)水平。簡(jiǎn)要操作：首先將各試劑平衡至室溫。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔并加樣，37 ℃孵育90 min。棄去液體，甩干，每個(gè)孔中加入Detection Ab 工作液100 μL，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次。每孔加HRP Conjugate 工作液100 μL，37 ℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每孔加底物溶液90μL，37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，待藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色時(shí)立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的A值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以（xˉ±s）表示，各組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后炎性因子表達(dá)qPCR結(jié)果顯示，0～72 h感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成的TNF-α和IFN-β mRNA水平呈現(xiàn)先上升（24 h最高）后下降的趨勢(shì)，與0 h比較，其余時(shí)間點(diǎn)TNF-α和IFN-β mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而IL-6和IL-10 mRNA則呈現(xiàn)持續(xù)升高，與0 h比較，其余時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的分泌水平ELISA結(jié)果顯示4 種炎性因子的表達(dá)均呈逐漸升高的趨勢(shì)，24、36、48、72 h 均較0 h 明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表1 SFTSV 刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后炎性因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量（xˉ±s，n=3）Table 1 Relative mRNA expression of inflammatory factors after SFTSV stimulation of primary peritoneal macrophages in mice（xˉ±s，n=3）

表2 SFTSV 刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后炎性因子的蛋白分泌水平（xˉ±s，pg/mL，n=3）Table 2 Protein secretion of inflammatory factors after SFTSV stimulation of primary peritoneal macrophages in mice（xˉ±s，pg/mL，n=3）

2.3 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后TLR2 的表達(dá)結(jié)果顯示，感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成的TLR2 mRNA 表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h 上升達(dá)到最高水平，6、12、24、36、48、72 h 與0 h相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。TLR2蛋白在感染后隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸升高，提示SFTSV感染可以刺激TLR2蛋白表達(dá)，且隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)累積表達(dá)量逐漸升高，見圖2。

圖1 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中TLR2的表達(dá)Figure 1 Expression of TLR2 in primary peritoneal macrophages of mice

圖2 TLR2蛋白表達(dá)水平Figure 2 Protein expression level of TLR2

3 討 論

本研究首先觀察了SFTSV 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，SFTSV明顯促進(jìn)了炎性因子TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的分泌，且具有劑量依賴性。有學(xué)者對(duì)SFTS 患者體內(nèi)的炎性因子進(jìn)行研究，結(jié)果表明SFTS 患者TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-α和IFN-γ表達(dá)明顯高于健康人［11］。另一個(gè)研究報(bào)道SFTS患者體內(nèi)IL-6和TNF-α明顯升高，而IFN-β 表達(dá)則是下降的［15］。本實(shí)驗(yàn)中IFN-β mRNA和蛋白水平在感染后是升高的，這一差別可能是由于本研究觀察的只是病毒對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響，機(jī)體有多種不同的免疫細(xì)胞，患者血清細(xì)胞因子的表達(dá)水平是多種免疫細(xì)胞綜合作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中TNF-α和IFN-β mRNA 于病毒感染后第24小時(shí)達(dá)到高峰，之后出現(xiàn)下降，但在培養(yǎng)上清中TNF-α 和IFN-β 蛋白表達(dá)則隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高。對(duì)此mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間不同步的現(xiàn)象，我們推測(cè)是由于真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯存在時(shí)空間隔，mRNA 與蛋白質(zhì)表達(dá)水平之間的關(guān)系并不是嚴(yán)格的線性關(guān)系，而是一種更為復(fù)雜的依賴關(guān)系，不同的調(diào)控機(jī)制（如合成和降解速率）作用于合成的mRNA和蛋白，對(duì)表達(dá)量會(huì)有不同的影響［16］。

本研究結(jié)果表明，SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后TLR2 mRNA 表達(dá)升高較為明顯，在第24 小時(shí)升高達(dá)到頂峰。Western blot 結(jié)果顯示TLR2 蛋白表達(dá)隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多。提示SFTSV 刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可上調(diào)TLR2 的表達(dá)。有研究表明TLR2 在登革熱病毒感染者的PBMC 中表達(dá)上調(diào)［17］，說明TLR2 在識(shí)別登革熱病毒中發(fā)揮重要的作用。H1N1、RSV和成人社區(qū)獲得性肺炎常見病毒可激活TLR2 胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究結(jié)果中TLR2 表達(dá)升高，與其研究結(jié)果相似［18-20］。這些都提示TLR2 在病毒感染中發(fā)揮重要作用，在病毒感染后TLR2 激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)關(guān)鍵炎性因子如IFNs 的產(chǎn)生［21］。有研究提示漢坦病毒的基因重排將對(duì)病毒的毒力變化有所影響，對(duì)于與漢坦病毒相似的SFTSV 則需要進(jìn)一步研究［22］。另一結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞在機(jī)體早期防御煙曲霉感染中發(fā)揮著重要作用，而且通過增強(qiáng)其作用，可加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺滅作用［23］。因此，評(píng)估在TLR2 存在或不存在時(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)SFTSV 感染的反應(yīng)是一項(xiàng)重要的工作。本研究接下來將對(duì)巨噬細(xì)胞的TLR2表達(dá)進(jìn)行下調(diào)或阻斷，再觀察各炎性因子的變化。

SFTSV可以通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路來促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)，引起的炎性因子風(fēng)暴是SFTS發(fā)生發(fā)展的重要原因。本研究證實(shí)SFTSV 感染能促進(jìn)巨噬細(xì)胞上調(diào)TLR2 的表達(dá)，可能導(dǎo)致炎性因子分泌增加，為尋找治療SFTS的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。