蔣迎娣，殷 瑩，浦浙寧，張 博，龔玲麗，胡亞玲，紀(jì) 麗，汪京京，張真豪，鄒 健

0 引 言

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma，GBM）是人腦最常見的腫瘤。其主要特點(diǎn)是高增殖性和侵襲性，腫瘤無明確邊界，極易復(fù)發(fā)，平均中位生存時(shí)間僅15 個(gè)月［1-3］。目前，GBM 主要治療手段是手術(shù)切除聯(lián)合放化療。而替莫唑胺作為一線化療藥有效率僅為45%左右，雖能在短期內(nèi)提高患者生存時(shí)間，但由于腫瘤異質(zhì)性的存在最終產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［4-6］。GBM 是一種典型的具有高度異質(zhì)性的腫瘤，腫瘤組織中細(xì)胞、基因的時(shí)空異質(zhì)性是產(chǎn)生耐藥和復(fù)發(fā)的分子基礎(chǔ)［7-9］。人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞細(xì)胞系U87是被廣泛使用的一種GBM 工具細(xì)胞系，在體外培養(yǎng)條件下存在多種形態(tài)，如典型的細(xì)長形細(xì)胞和短梭形細(xì)胞，因此U87也被作為GBM異質(zhì)性研究的模型［10］，但從基因水平探討其異質(zhì)性來源的研究較少。本研究旨在構(gòu)建人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87 單克隆細(xì)胞株，經(jīng)鑒定后檢測不同單克隆細(xì)胞株的表型和遺傳背景差異，并探討產(chǎn)生表型差異的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，并由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增和保存。DMEM 培養(yǎng)基、D/F12 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗混合液和0.25%胰蛋白酶溶液購自美國HyClone 公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿以及鼠尾膠原I購自美國Corning公司；細(xì)胞爬片購自上海臥宏生物科技有限公司；3D細(xì)胞侵襲裝置購買于美國AIMBiotech Pte Ltd 公司；B-27、GlutaMAX 添加劑、重組人表皮生長因子、10×PBS、鼠單克隆抗體Beta-tubulin、驢抗鼠熒光二抗Alexa Flour 488 和Hoechest 33342購自美國ThermoFisherScientific 公司；牛血清白蛋白、Fluoromount 封片劑、曲拉通（TritonX-100）、酚紅鈉鹽和TRIzol試劑購自美國Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒購自美國Bimake 公司；kFluor555-EdU 法細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細(xì)胞凋亡流式檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；鬼筆環(huán)肽購自美國Cell Signaling Technology 公司；阿霉素購自美國Selleck公司；驢血清購自美國Jackson ImmunoResearch 公司；CFSE 購自英國Abcam 公司；4%多聚甲醛溶液（4%PFA）和結(jié)晶紫染色液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 單克隆細(xì)胞株的篩選U87 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期U87 細(xì)胞，經(jīng)CFSE 染色后計(jì)數(shù)并進(jìn)行梯度稀釋制成細(xì)胞密度為100 個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，合計(jì)4 個(gè)96 孔板，待細(xì)胞貼壁后在熒光顯微鏡下觀察，選出僅有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔，作擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存保種，并根據(jù)單克隆化的細(xì)胞形態(tài)特征，最終選取2 株典型特征的細(xì)胞（分別命名為CF5和G11）作為后續(xù)研究的對象細(xì)胞。

1.2.2 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)前將經(jīng)包被處理過的細(xì)胞爬片放入24孔板中，取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)。以2×104/孔種于爬片，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后4%PFA 固定15 min，用 含0.3% Triton-X 100 的PBS 通 透15 min，驢血清室溫封閉1 h 后將鼠抗Beta-tubulin 加入爬片，4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBS 洗滌后加入驢抗鼠Alexa Flour 488 二抗室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次后用含Hoechst 33342 的Fluoromount 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 CCK-8 法和EdU 摻入成像法檢測細(xì)胞增殖能力取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，以1000/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（第0、24、48、72、96 小時(shí)）檢測。每100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm 波長下吸光度值（A），以第0 天即接種4 h后的A值為1，繪制細(xì)胞生長曲線。

取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，以2×104/孔接種于細(xì)胞爬片，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后換為含有10μmol/LEdU 完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，PBS 洗 滌 后4%PFA 室 溫 固 定15 min，用 含3%BSA-PBS 洗 滌3 次，0.3%Triton-X 100-PBS 室 溫破膜20 min 后洗滌3 次。根據(jù)試劑盒說明書配置Click-iT 染色液，室溫避光孵育30 min，3% BSAPBS 洗滌3 次后用含Hoechst33342 的Fluoromount封片劑封片后，熒光顯微鏡下拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞比例。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，以1000/孔接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)14 d，4%PFA 室溫固定15 min，PBS 洗滌3 次，10%結(jié)晶紫染色15 min，洗滌后空氣干燥，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每組細(xì)胞的克隆形成數(shù)（＞50 個(gè)細(xì)胞為1 個(gè)克?。?。

1.2.5 干細(xì)胞樣細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞成球能力取對數(shù)生長期的U87、CF5和G11細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（由D/F12 培養(yǎng)液中加入20 ng/mL EGF、20 ng/mLbFGF、B27 和2 mmol/L GlutaMAX配制而成）培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞以5000/孔接種于低吸附6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)15 d，用EVOSTM FL Auto 細(xì)胞成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞球個(gè)數(shù)及直徑（＞50μm為1個(gè)克隆球）。

1.2.6 免疫熒光法和CCK8 法黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞黏附能力取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，以2×104/孔接種于細(xì)胞爬片，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，取出爬片用PBS洗去未黏附的細(xì)胞，4% PFA 固定15 min，0.3%TritonX-100-PBS 通透20 min 后，用DyLight?554 Phalloidin室溫孵育20 min，經(jīng)PBS 洗滌后用含Hoechst33342的Fluoromount 封片劑封片，每張爬片隨機(jī)選取10個(gè)視野熒光顯微鏡拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞黏附面積。

將對數(shù)期生長的U87、CF5 和G11 細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［11］，37 ℃培養(yǎng)1 h 后用PBS 清洗未黏附的細(xì)胞，并加入CCK-8 試劑檢測吸光度A 值，以黏附細(xì)胞吸光度A 值與總細(xì)胞A 值的比值計(jì)算黏附率，并將U87細(xì)胞黏附率設(shè)為1。

1.2.7 3D 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力參照文獻(xiàn)［12-13］配制2.0 mg/mL 鼠尾膠Collagen I（由10×PBS、NaOH、鼠尾膠以及雙蒸水配制而成）。將膠從3D侵襲裝置中間孔加入，37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min使其凝固。以DMEM 水化3D 裝置中Collagen I 左右兩側(cè)通道，左側(cè)通道上下2 個(gè)孔各加70μL DMEM，并在左側(cè)通道入口處加入20 μL 上述細(xì)胞懸液，右側(cè)通道2 個(gè)孔也各加入70 μL DMEM 培養(yǎng)基，將裝置放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，將右側(cè)無細(xì)胞通道側(cè)的DMEM培養(yǎng)基更換為含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，形成血清濃度差，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用PBS 洗滌3 次后固定通透，DyLight?594 Phalloidin室溫孵育1 h 后PBS 洗滌3 次，加入PBS 稀釋的Hoechst 33342 后熒光顯微鏡拍照，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)各組穿過CollagenI的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Annexin V-AlexaFluor647/PI雙染法流式檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的U87、CF5 和G11 細(xì)胞，以1×105/孔接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，24 h后更換培養(yǎng)基為無血清DMEM同時(shí)加入阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，繼續(xù)培24h。按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析按RNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司）方法提取細(xì)胞RNA，選擇純度較好（紫外260OD/280OD 為1.8-2.1）的樣本進(jìn)行RNA 變性膠電泳質(zhì)檢，樣本-80 ℃保存?zhèn)溆?。建庫后，使用HiSeq 3000（Illumina 公司）測序儀進(jìn)行上機(jī)檢測，CASAVA v1.8.2 軟件將原始測序數(shù)據(jù)（Bcl 文件）轉(zhuǎn)換成fastq 格式以備用，使用FastQC v0.11.2 軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對前的初始質(zhì)量檢查，并以人類基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（GRCh37）為參考庫，綜合使用TopHat2、bowtie 軟件包對序列進(jìn)行比對拼接產(chǎn)生數(shù)據(jù)（bam 文件），用bedtools v2.22.1和python腳本程序等將bam 文件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化、并以mRNA表達(dá)值差異2倍以上的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異基因篩選和數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析包括：基因表達(dá)定量、表達(dá)分布、差異表達(dá)分析、KEGG和GO功能通路富集分析等。

1.2.10 RT-PCR 檢測細(xì)胞中ITGA6、ITGA11 的表達(dá)水平TRIzol法提取U87、CF5和G11細(xì)胞的總RNA并檢測其純度及濃度。取2μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；取2μL cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸15 s，共40次循環(huán)。引物序列分別為：ITGA6 上游：5′-CGAAACCAAGGTTCTGAGCCCA-3′，下游：5′-CTTGGATCTCCACTGAGGCAGT-3′；ITGA11 上游：5′-GCCTCCAGTATTTTGGCTGCAG-3′，下游：5′-GCTCAAAGTGGAGGCTGGCATT-3′；內(nèi)參引物GAPDH上游：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；下游：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算ITGA6和ITGA11mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 和Graphpadprism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。多個(gè)樣本組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 U87 單克隆細(xì)胞株的篩選構(gòu)建可見混合型U87形態(tài)多樣，大小不一，而經(jīng)單克隆化后細(xì)胞株形態(tài)較為均一，其中CF5小而短粗，G11大而細(xì)長。見圖1。STR 分型鑒定顯示，3 株細(xì)胞與美國模式培養(yǎng)物研究所中參考細(xì)胞系匹配率均為86.67%，因此可認(rèn)為本研究使用的U87 以及2 株單克隆細(xì)胞CF5 和G11均來源于人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87。

2.2 U87、CF5 和G11 細(xì)胞株的增殖能力、平板克隆和干細(xì)胞成球能力比較CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87、CF5 和G11 細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)增殖能力差異明顯（P＜0.05）。CF5細(xì)胞增殖能力較U87、G11明顯增強(qiáng)，U87較G11明顯增強(qiáng)（P＜0.001），見表1。

EdU 摻入成像法增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CF5 細(xì)胞EdU 陽性細(xì)胞比例（0.54±0.05）較U87、G11（0.44±0.03）、（0.35±0.03）明顯增強(qiáng)，U87 較G11 明顯增強(qiáng)（P＜0.01），見圖2。

圖1 明場和熒光視野下的3株細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 1 Morphology of the three cell lines under the phase-contrast and fluorescence microscope（×200）

表1 CCK-8檢測不同時(shí)間各組細(xì)胞相對增殖率比較（xˉ±s）Table 1 Relative proliferation of the three cell lines at different time points（xˉ±s）

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，CF5 細(xì)胞克隆形成能力［（88.33±3.06）個(gè)］較U87、G11［（53.67±3.06）、（42.00±3.00）個(gè)］明顯增強(qiáng)，U87較G11明顯增強(qiáng)（P＜0.01），見圖2。

腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)顯示，CF5 細(xì)胞干細(xì)胞球的直徑［（281.8±83.83）μm］較U87、G11［（241.6±66.48）μm、（176.9±47.09）μm］明顯增強(qiáng)，U87 較G11明顯增強(qiáng)（P＜0.01），見圖2。

圖2 3株細(xì)胞的增殖能力、克隆形成和干細(xì)胞成球能力Figure 2 Proliferation，colony formation and tumor sphere formation of the glioblatoma U87 monoclonal cells

2.3 U87、CF5 和G11 細(xì)胞株粘附和侵襲能力的比較黏附1 h后，U87、CF5和G11平均黏附面積分別為（1459±164.1）μm2、（878.2±55.96）μm2和（2168±438.8）μm2，G11 黏 附 面 積 最 大，CF5 最 ?。≒＜0.001），見圖3。

CCK-8 法黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黏附1 h 后，U87、CF5 和G11 細(xì)胞平均相對黏附率分別為（1.00±0.08）、（0.81±0.03）和（1.14±0.01），G11 黏附率能力最強(qiáng)，U87次之，CF5最弱（P＜0.001）。

3D 培養(yǎng)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87、CF5 和G11 細(xì)胞72h內(nèi)從基質(zhì)膠接口處遷移到基質(zhì)膠內(nèi)細(xì)胞數(shù)量分別為（73.31±5.43）個(gè)、（34.01±4.55）個(gè)和（179.8±26.14）個(gè)，G11 細(xì)胞侵襲能力最強(qiáng)，CF5 最弱（P＜0.05），見圖4。

圖3 免疫熒光法檢測細(xì)胞平均黏附面積（×200）Figure 3 Immunofluorescence images of the adhesion areas of the three cell lines（×200）

圖4 3D培養(yǎng)侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力（×100）Figure 4 3D culture images of the invasion ability of the three cell lines（×100）

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測3株細(xì)胞凋亡能力Figure 5 Apoptosis of the three cell lines detected by flow cytometry

2.4 U87、CF5 和G11 細(xì)胞株對藥物誘導(dǎo)凋亡敏感性的比較Doxorubicin 的促凋亡反應(yīng)，U87、CF5 和G11 3 組細(xì)胞凋亡率分別為（8.75±0.09）%、（4.98±0.83）%和（11.23±0.80）%，CF5 耐受性最強(qiáng)，G11 最弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。2.5 U87、CF5 和G11 細(xì)胞基因調(diào)控通路差異轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，3 株細(xì)胞在基因表達(dá)層面存在較大差異，見圖6。交互分析發(fā)現(xiàn)CF5 相對G11 和U87 均下調(diào)的基因有159 個(gè)，均上調(diào)的基因有303個(gè)；G11 相對CF5 和U87 均下調(diào)的基因有281 個(gè)，上調(diào)的基因則有116 個(gè)；通路富集分析顯示CF5 和G11 在細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的通路有最高的富集度，而細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路與腫瘤侵襲、耐藥等功能表型密切相關(guān)。因此，挑選了其中代表性的同一家族差異基因ITGA6和ITGA11進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

熒光定量PCR 結(jié)果顯示，G11 ITGA6 相對表達(dá)量（1.62±0.10）較U87、CF5（1.01±0.16、0.08±0.01）明顯增高，U87 較CF5 明顯增高（P＜0.05）。CF5 ITGA11 表 達(dá) 量（3.10±0.58）較U87、CF5（1.00±0.11、0.10±0.02）明 顯 增 高，U87 較CF5 明 顯 增 高（P＜0.05）。熒光定量PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致。

圖6 3株細(xì)胞差異基因表達(dá)情況Figure 6 Differential gene expressions in the three cell lines determined by qRT-PCR

3 討 論

腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，腫瘤在生長過程中，經(jīng)過多次分裂增殖，其子細(xì)胞呈現(xiàn)出分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而使不同克隆亞群在生長速度、侵襲能力、藥物敏感性、預(yù)后等方面產(chǎn)生差異［14-15］。而腫瘤干細(xì)胞克隆選擇性、基因組不穩(wěn)定性和進(jìn)化差異是導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性的重要原因［16-17］。在腫瘤研究中，細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)是必不可少的，來源更單一的細(xì)胞系，受體外培養(yǎng)條件和傳代次數(shù)的影響，細(xì)胞間也存在較大差異［18-19］。細(xì)胞間特定基因或分子功能簇的差異會導(dǎo)致一些功能基因的過表達(dá)或敲減/敲除達(dá)不到所對應(yīng)的功能表型。因此，從混合細(xì)胞或細(xì)胞株中依據(jù)特定標(biāo)志物、形態(tài)和功能差異挑選單一細(xì)胞，擴(kuò)增并構(gòu)建細(xì)胞株，并從基因?qū)W背景尋找不同單克隆細(xì)胞株異質(zhì)性差異，對后續(xù)挑選合適的細(xì)胞進(jìn)行分子和藥物研究具有指導(dǎo)意義。

本研究構(gòu)建了多個(gè)U87 的單克隆細(xì)胞株，這些細(xì)胞在形態(tài)、功能表型上存在較大差異。結(jié)果顯示，CF5 細(xì)胞株具有典型的短梭形形態(tài)特征，其增殖、干細(xì)胞成球和抗凋亡能力最強(qiáng)；而G11呈細(xì)長形態(tài)，其黏附和侵襲能力最強(qiáng)，增殖、干細(xì)胞成球和抗凋亡能力卻較弱。轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息分析顯示，即使在全程平行培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞間也存在大量差異表達(dá)基因。富集分析展示了差異表達(dá)基因所影響的通路和功能的差異。CF5 和G11 下調(diào)基因在細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路上均有最高富集度，而細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路與惡性腫瘤功能表型和預(yù)后密切相關(guān)，比如整合素家族基因ITGA6、ITGA11 及賴氨酰氧化酶等，在腫瘤侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用［20-22］。另外即使CF5 和G11 下調(diào)基因在細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路上均有最高富集度，但是所富集到的基因完全不同，提示這2 株細(xì)胞在生物學(xué)表型上的差異由不同的基因或基因集所驅(qū)動(dòng)。另外，PCR 結(jié)果顯示，上述提到的基因在3 株細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著差異，因此在研究基因功能時(shí)宜根據(jù)基因表達(dá)差異對所選細(xì)胞進(jìn)行針對性的過表達(dá)/敲減、敲除等操作，而不宜用混合型細(xì)胞。通過本研究，我們認(rèn)為造成相同培養(yǎng)環(huán)境下單克隆細(xì)胞株功能表型的差異來源于細(xì)胞間基因背景的差異，而這些基因表達(dá)差異的來源則需要更深入的研究。同時(shí)，這些結(jié)果也提示我們在研究基因、蛋白等分子在腫瘤細(xì)胞中功能表型及機(jī)制時(shí)，需明確這些分子在所選細(xì)胞中的表達(dá)情況。

綜上所述，本研究篩選建立的單克隆細(xì)胞株為GBM 功能學(xué)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一個(gè)有用的細(xì)胞模型，同時(shí)篩選出的單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄組測序信息也為后續(xù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤異質(zhì)性機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。