楊軍，曹菊秀，楊文華，王艷菊

利用細(xì)胞破碎法提取螺旋藻中葉綠素的提取液研究

楊軍，曹菊秀，楊文華，王艷菊

（云南省麗江市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 麗江 674100）

在螺旋藻葉綠素檢測(cè)中目前采用《進(jìn)出口螺旋藻中藻藍(lán)蛋白、葉綠素含量的測(cè)定方法》（SN/T 1113—2002），該方法樣品前處理需要反復(fù)研磨、萃取、洗滌等10多個(gè)步驟，客觀(guān)存在耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)檢驗(yàn)人員在各個(gè)環(huán)節(jié)的把控能力要求較高、單次檢測(cè)時(shí)容易產(chǎn)生較大誤差、多次復(fù)測(cè)時(shí)重現(xiàn)性差等問(wèn)題。而采用超聲破壁、離心分離的方法，不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，且結(jié)果的復(fù)現(xiàn)性穩(wěn)定。重點(diǎn)研究了在對(duì)螺旋藻中的葉綠素進(jìn)行提取時(shí)所使用的提取液。

細(xì)胞破碎；葉綠素；提取液；丙酮

葉綠素是高等植物和其他所有能進(jìn)行光合作用的生物體含有的一類(lèi)綠色色素，屬于脂溶性色素，存在于一切綠色植物中，可溶于乙醚、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于水。因此，可用極性溶劑如乙醚、丙酮、乙醇等進(jìn)行葉綠素提取。

1 擬定提取液組合

為了尋找到最佳的葉綠素提取液組合，本試驗(yàn)依據(jù)實(shí)施方案對(duì)多種有機(jī)溶劑進(jìn)行了組合，具體情況如表1所示。

表1 提取液及其組合比例

序號(hào)試劑組合組合比例（體積比） 1無(wú)水乙醇1 2無(wú)水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）1∶1 3無(wú)水乙醇-乙醚2∶1 4無(wú)水乙醇-乙醚1∶2 5丙酮1 6丙酮-乙醇1∶2 7丙酮-乙醚1∶1 8丙酮-無(wú)水乙醇-乙醚1∶1∶1 9丙酮-乙醇1∶1 10丙酮-水85∶15 11質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 12質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇3∶1 13質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇2∶1 14質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶2 15質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 16質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶3 17質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶4 18丙酮-乙醇-水4.5∶4.5∶1

2 提取液的篩選

在提取液的篩選試驗(yàn)中，本試驗(yàn)將篩選過(guò)程分為以下3個(gè)階段：①初選階段。從18組中選出分層較好的7組。

②復(fù)選階段。從7組中選擇提取效果最佳的1組。③確定階段。通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證提取液的有效性。

3 篩選試驗(yàn)

3.1 初選

操作步驟：本試驗(yàn)將《進(jìn)出口螺旋藻中藻藍(lán)蛋白、葉綠素含量的測(cè)定方法》（SN/T 1113—2002）中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%丙酮水溶液替換成表1中的18種提取液組合進(jìn)行試驗(yàn)。挑選出了7組分層效果好的提取液，如表2所示。

表2 初選提取液一覽表

序號(hào)提取液分層效果初選結(jié)果 1無(wú)水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）很好保留 2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-無(wú)水乙醇（V/V=1∶1）較好保留 3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-無(wú)水乙醇（V/V=3∶1）較好保留 4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-無(wú)水乙醇（V/V=2∶1）較好保留 5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-無(wú)水乙醇（V/V=1∶2）較好保留 6質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮水溶液-無(wú)水乙醇（V/V=1∶1）較好保留 7丙酮-乙醇-水（V/V/V=4.5∶4.5∶1）較好保留

3.2 復(fù)選試驗(yàn)

本試驗(yàn)針對(duì)初選的7組提取液進(jìn)行了結(jié)果分析，研究其提取效果。操作步驟：稱(chēng)取樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）至15 mL具塞塑料離心管中；加入10 mL提取液，第一次超聲提取30 min，3 000 r/min離心5 min，提取液轉(zhuǎn)入125 mL分液漏斗（部分盛有20 mL的水，部分不加水）中；向15 mL離心管中加入10 mL提取液，振搖混合，第二次超聲提取15 min，3 000 r/min離心5 min，提取液并入125 mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入20 mL乙醚，之前未加水的加入20 mL水，輕搖，靜置分層，棄去水層；用水洗滌2次，每次20 mL，輕搖，靜置分層，棄去水層；將乙醚層通過(guò)一裝

有5 g無(wú)水硫酸鈉的小漏斗，濾入50 mL棕色容量瓶中，用少量乙醚洗滌分液漏斗，并洗去無(wú)水硫酸鈉層中的色素，定容，搖勻，待測(cè)；將上述待測(cè)液立即于分光光度計(jì)上測(cè)定642 nm及660 nm處的吸光值，1 cm比色皿，乙醚作空白；運(yùn)用《進(jìn)出口螺旋藻中藻藍(lán)蛋白、葉綠素含量的測(cè)定方法》（SN/T 1113—2002）中的計(jì)算方法計(jì)算。

本試驗(yàn)采用上述方法共進(jìn)行了4次復(fù)選試驗(yàn)，結(jié)果如下所示。

3.2.1 第一次提取液復(fù)選試驗(yàn)

第一次提取液復(fù)選試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 第一次提取液復(fù)選結(jié)果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃；時(shí)間方面，第一次為30 min，第二次為15 min 序號(hào)提取液稱(chēng)樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1)0.101 30.2041.25512.366610.4 2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2)0.101 70.4721.50918.674918.1 3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1)0.104 90.4481.98921.6941 034.0 4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1)0.104 40.181.08110.721513.5 5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1)0.102 90.2151.29312.815622.7 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1)0.101 30.4131.98721.0831 040.6 0.104 40.4082.04821.4391 026.8 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1)0.102 60.3001.70417.169836.7 0.102 00.3681.96220.152987.8

分析：采用乙醇-乙醚（/= 1∶1）、丙酮-乙醇-乙醚（//=1∶1∶1）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶1）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2），這四組提取效果較好。從分層的速度來(lái)看，乙醇-乙醚（/=1∶1）分層最快。

3.2.2 第二次提取液復(fù)選試驗(yàn)

通過(guò)第一次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將提取液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，分層效果會(huì)受到加水量的影響。因此在本次試驗(yàn)中加入2個(gè)第一次加水量為40 mL的試驗(yàn)組作為對(duì)比。第一次超聲時(shí)間為30 min，第二次超聲時(shí)間為10 min，其余條件與第一次提取液復(fù)選試驗(yàn)相同。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

分析：通過(guò)第二次提取液復(fù)選試驗(yàn)，1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)提取液提取效果較好。從分層的難易程度分析，6號(hào)分層最快，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于其余組別仍然較高，7號(hào)檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差。

3.2.3 第三次提取液復(fù)選試驗(yàn)

通過(guò)第二次復(fù)選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)的第一次加水順序?qū)Ψ謱有Ч绊戄^大。本次試驗(yàn)1號(hào)和6號(hào)先向空分液漏斗中加入20 mL水，轉(zhuǎn)移提取液后加入20 mL乙醚；其余5個(gè)試驗(yàn)組先向空分液漏斗中轉(zhuǎn)移提取液，再順次加入20 mL乙醚和20 mL水進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

分析：1號(hào)分層效果不佳，所以未進(jìn)行結(jié)果的測(cè)定；1號(hào)在前兩次試驗(yàn)中能分層但耗時(shí)長(zhǎng)，本試驗(yàn)計(jì)劃在下次試驗(yàn)中改變加水順序繼續(xù)研究；2號(hào)檢測(cè)數(shù)值最大（1 120.1 mg/100 g）。

表4 第二次提取液復(fù)選結(jié)果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃；時(shí)間方面，第一次為30 min、第二次為10 min；第一次加水：空分液漏斗中先加水，1～6號(hào)、8號(hào)為20 mL，7號(hào)、9號(hào)為40 mL 序號(hào)提取液稱(chēng)樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.102 70.3151.98619.435946.2 2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2）0.105 40.2761.62816.231770.0 3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.102 30.3341.98719.759965.7 4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.102 30.2571.55415.388752.1 5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.1090.6426.402316.6 6乙醇-乙醚（V/V= 1∶1）0.101 10.3432.08220.5861 018.1 0.101 50.3422.07920.5481 012.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.102 30.1821.13411.135544.2 0.102 70.0240.1381.38867.6

表5 第三次提取液復(fù)選結(jié)果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃，時(shí)間方面，第一次為30 min、第二次為10 min；加水順序：2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)試驗(yàn)組先加入20 mL乙醚后再加入20 mL水；1號(hào)、6號(hào)先加20 mL水再加入20 mL乙醚 序號(hào)提取液稱(chēng)樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.100 9//// 2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4112.20922.6271 121.3 3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3512.13521.1011 044.6 4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.3642.24122.0741 090.6 5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.100 90.3602.1921.6411 072.4 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.100 50.3232.01619.780984.1 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 30.3492.12220.9691 035.0

3.2.4 第四次提取液復(fù)選試驗(yàn)

本次試驗(yàn)6號(hào)先加入20 mL水，其余6組順次加入20 mL乙醚和20 mL水，檢測(cè)結(jié)果如表6所示。

分析：1號(hào)改變加水順序，檢測(cè)結(jié)果超過(guò)1 000 mg/100 g，再次證明第一次加水的順序?qū)β菪逯腥~綠素的分層效果影響很大。

表6 第四次提取液復(fù)選結(jié)果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃，時(shí)間方面，第一次為30 min、第二次為10 min。第一次加水：1～5號(hào)及7號(hào)試驗(yàn)組先加入20 mL乙醚再加20 mL水，6號(hào)先加入20 mL水再加入20 mL乙醚 序號(hào)提取液稱(chēng)樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.101 00.3812.23922.3501 106.4 2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4642.28624.0791 192.0 3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3662.21821.9391 083.9 4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.1691.02910.162502.1 5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.3592.18821.6071 068.6 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.101 20.3422.10920.7701 026.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 20.3221.98319.531965.0

3.3 試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)復(fù)選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）時(shí)，檢測(cè)值最大且穩(wěn)定性最好，所以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液最有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，研究了第一次加水的用量和順序?qū)Ψ謱有Ч挠绊憽?/p>

4 小結(jié)

通過(guò)本次試驗(yàn)研究得出如下結(jié)論：①質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液為超聲提取葉綠素的最佳試劑組合，提取效果最佳；②加水順序直接影響分層效果，提取液轉(zhuǎn)移后先加入20 mL乙醚，再加入20 mL水的分層效果最佳。

［1］羅光宏，許耀照，何琳，等.影響分光光度法測(cè)定螺旋藻葉綠素含量的因素分析［J］.食品科學(xué)，2014，35（14）：151-154.

［2］付麗麗，金晶，吉美萍，等.螺旋藻葉綠素a提取方法探討［J］.應(yīng)用化工，2015，44（12）：2196-2198.

［3］楊軍，曹菊秀，王艷菊，等.超聲波細(xì)胞破碎法對(duì)螺旋藻中葉綠素提取研究［J］.中國(guó)測(cè)試，2018（Suppl 2）：1-2.

Q945

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.17.003

2095－6835（2019）17－0007－03

楊軍（1975—），男，云南麗江人，本科，高級(jí)工程師，主要從事產(chǎn)品質(zhì)量管理與研究。

〔編輯：張思楠〕