劉潔 朱清 江梅 丁濤 姜經(jīng)航 曹玉平 王開秀 蔡麗麗 王婷婷 邵帥

湖北省荊門市第二人民醫(yī)院1病理科，3生殖醫(yī)學(xué)中心（湖北荊門448000）；2廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室（廣州511436）

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌［1］。宮頸癌大約占全球癌癥新發(fā)病率的9%，女性癌癥病死率的8%［2］，2018年宮頸癌新增病例大約57 萬，并且宮頸癌死亡人數(shù)為31.1 萬，但在美國20 ～39 歲的女性中，宮頸癌的死亡率排第2 名［3-4］。80%以上的宮頸癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家，而我國又是發(fā)展中國家宮頸癌高發(fā)地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率高居世界前列，發(fā)病率逐年上升，并且發(fā)病年齡逐漸年輕化［5］。因此，從機制上探索宮頸癌的治療方法已經(jīng)刻不容緩了。

增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）與細胞DNA 合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的有效指標［6］。PCNA 參與宮頸癌疾病的發(fā)生、疾病發(fā)展以及浸潤，并且與宮頸癌的分化程度也密切相關(guān)［7］；γ-三烯生育酚抑制宮頸癌細胞的增殖以及誘導(dǎo)細胞的凋亡也與PCNA 有關(guān)［8］。因此，PCNA 在宮頸癌細胞的增殖凋亡中扮演著重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤增生有關(guān)的Sonic hedgehog（Shh）信號通路與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］，Shh 信號不僅參與宮頸癌細胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移等，而且與宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)［10］；研究［2］顯示Shh 基因沉默抑制Shh 信號通路后能夠抑制宮頸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲以及轉(zhuǎn)移。盡管Shh 信號通路在宮頸癌中的發(fā)生發(fā)展中關(guān)系密切，然鮮有關(guān)于抑制Shh 信號通路對宮頸癌細胞增殖凋亡影響以及相關(guān)機制的研究報道，因此，本研究主要探討抑制Shh 信號通路對宮頸癌細胞增殖凋亡影響是否與PCNA 有關(guān)，以便為宮頸癌的臨床治療提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料Hela 細胞株為廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室所有。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、青霉素、鏈霉素均購自美國GIBCO 公 司；Cyclopamine 購 自 美 國Santa Cruz 公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒、RNase-free H2O 購自TakaRa 公司；CCK-8 試劑盒、Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天公司；PCNA 抗體購自美國Santa Cruz 公司、Bax、Bcl-2 抗體購自Abcam 公司；β-actin、HRP-山羊抗兔購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物由invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Hela 細胞培養(yǎng)將Hela 細胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素）中，置于37 ℃、含5%CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換液體。

1.2.2 細胞處理及分組Hela 細胞貼壁生長狀態(tài)良好后消化細胞，以1×105/mL 接種于6 孔板培養(yǎng)，每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基。第2 天換液后將細胞分為對照組和Cyclopamine 組：Cyclopamine 組包括Cyc-1 組、Cyc-2 組、Cyc-3 組，分別給予10、20、40 μmol Cyclopamine 孵育；對照組給予等量生理鹽水。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測Trizol 法提取各組細胞總RNA，采用RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，添加相關(guān)引物擴增各基因。采用NanoDrop-1000 分光光度計、ABI 7500 軟件檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 表達水平。熒光定量PCR 擴增條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，擴增完畢后分析擴增曲線和溶解曲線，每組實驗均重復(fù)3 次。β-actin、Smo、Gli1 的引物序列見表1。

表1 RT-PCR 檢測β-actin、Smo、Gli1 的引物Tab.1 Primer sequences of β-actin，Smo，Gli1

1.2.4 MTT 檢測細胞抑制率將Hela 細胞以1 ×104/100 μL 接種于96 孔板中，實驗分為對照組和Cyclopamine 組（Cyc-1、Cyc-2、Cyc-3），每組6 個重復(fù)。96 孔板周圍一圈用滅菌PBS 代替，空白組只加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基180 μL，再加20 μL MTT 溶液（5 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入150 μL 的DMSO 振蕩至藍紫色結(jié)晶溶解，最后酶標儀檢測OD值。細胞抑制率= 1-（用藥組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）× 100%。

1.2.5 Caspase-3 和Caspase-9 活性檢測將Hela細胞接種于6 孔板中，待細胞生長過夜后，按上述方法培養(yǎng)和處理細胞后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后加入裂解液重懸細胞，冰浴裂解15 min，4 ℃，12 000 r/min 條件下離心10 min 收集上清液。根據(jù)試劑盒說明，以405 nm 波長測定吸光度OD值，建立標準曲線并測定Caspase-3、Caspase-9 的含量。

1.2.6 Western Blot 檢測PCNA、Bax 和Bcl-2 蛋白表達按上述方法培養(yǎng)和處理細胞后提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，調(diào)平各組細胞濃度，各組取40 μg 蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后275 mA 電流2 h 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用封閉液（50 g/L BSA、0.1% Tween-20 TBS）封閉后，加β-actin、PCNA、Bax 和Bcl-2 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜；次日，二抗于室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclopamine 對Shh 信號通路的抑制情況Q-PCR 結(jié)果顯示：與對照組相比，Cyclopamine 藥物濃度為10 μmol 時Shh 信號通路處于抑制狀態(tài)（P＜0.01）；隨著Cyclopamine 藥物濃度的增大，Shh信號通路抑制情況更加明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 Cyclopamine 對Shh 信號通路的抑制情況Tab.2 Effects of Cyclopamine on Shh signaling pathway ± s

表2 Cyclopamine 對Shh 信號通路的抑制情況Tab.2 Effects of Cyclopamine on Shh signaling pathway ± s

注：與對照組相比，aP ＜0.01；與Cyc-1 組相比，bP ＜0.01；與Cyc-2 組相比，cP ＜0.01

組別對照組Cyc-1 組Cyc-2 組Cyc-3 組F 值P 值Smo mRNA 1.000 ± 0.044 0.819 ± 0.038a 0.635 ± 0.021a b 0.425 ± 0.036a b c 312.775＜0.001 Gli1 mRNA 1.000 ± 0.036 0.804 ± 0.040a 0.653 ± 0.029a b 0.410 ± 0.022a b c 193.261＜0.001

2.2 Cyclopamine 對Hela 細胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，當Cyclopamine 藥物濃度為10 μmol 時兩者沒有明顯變化；當Cyclopamine 藥物濃度為20μmol 時能夠抑制Hela 細胞的增殖（P＜0.01）；當Cyclopamine 藥物濃度為40 μmol 時Hela 細胞的抑制情況更加明顯（P＜0.01）。見圖1。

2.3 Cyclopamine 對Caspase-3 和Caspase-9 含量表達的影響ELISA 結(jié)果顯示：與對照組相比，Cyclopamine 藥物濃度為10μmol 時Caspase-3 表達升高（P＜0.01），而Caspase-9 無明顯變化；與Cyc-1組相比，當Cyclopamine 藥物濃度為20μmol 時Caspase-3 表達升高（P＜0.05），而Caspase-9 升高更加明顯（P＜0.01）；與Cyc-2 組相比，當Cyclopamine 藥物濃度為40 μmol 時Caspase-3 和Caspase-9 均表達升高（均P＜0.01）。見表3。

圖1 Cyclopamine 對Hela 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of Cyclopamine on Hela cell proliferation

表3 Cyclopamine 對Caspase-3 和Caspase-9 含量表達情況的影響Tab.3 Effects of Cyclopamine on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 ± s

表3 Cyclopamine 對Caspase-3 和Caspase-9 含量表達情況的影響Tab.3 Effects of Cyclopamine on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 ± s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與Cyc-1 組相比，bP ＜0.05，dP ＜0.01；與Cyc-2 組相比，cP ＜0.01

組別對照組Cyc-1 組Cyc-2 組Cyc-3 組F 值P 值Caspase-3 1.000±0.035 1.128±0.049a 1.233±0.067b 1.529±0.048c 61.016＜0.001 Caspase-9 1.000±0.029 1.082±0.028 1.203±0.012d 1.388±0.062c 71.553＜0.001

2.4 Cyclopamine 對PCNA、Bcl-2 和Bax蛋白的表達情況影響Western Blot 結(jié)果顯示：與對照組相比，Cyclopamine 藥物濃度為10 μmol 時增殖相關(guān)蛋白PCNA、抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 均無明顯變化；與Cyc-1 組相比，當Cyclopamine 藥物濃度為20 μmol 時Bax 表達升高（P＜0.05），而PCNA和Bcl-2 表達下降（均P＜0.01）；與Cyc-2 組相比，當Cyclopamine 藥物濃 度為40μmol 時Bax 表達升高（均P＜0.01），而PCNA 和Bcl-2 表達下降（均P＜0.01）。見圖2～5。

3 討論

圖2 Cyclopamine 對PCNA、Bcl-2 和Bax 蛋白的表達情況影響Fig.2 Effects of Cyclopamine on the expression of PCNA，Bcl-2 and Bax proteins

圖3 Cyclopamine 對Bax 蛋白的表達情況影響Fig.3 The effect of Cyclopamine on the expression of Bax protein

圖4 Cyclopamine 對Bcl-2 蛋白的表達情況影響Fig.4 The effect of Cyclopamine on the expression of Bcl-2 protein

圖5 Cyclopamine 對PCNA 蛋白的表達情況影響Fig.5 The effect of Cyclopamine on the expression of PCNA protein

宮頸癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是女性常見的惡性腫瘤之一［11］。數(shù)據(jù)顯示，大約90%的宮頸癌患者為低中等收入國家居民，有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，其總體預(yù)后仍然不佳［12］。手術(shù)、放療、化療等方法對早期宮頸癌比較有效，但對于晚期宮頸癌就顯得極其有限了。因此，從發(fā)病機制探討宮頸癌的治療方法就顯得極其重要。研究發(fā)現(xiàn)Shh 信號通路與宮頸癌存在一定的關(guān)聯(lián)，在宮頸癌組織中有Shh 信號和其相關(guān)下游分子FOXM1 表達［13］；在原位異種宮頸癌移植治療中抑制Shh 信號通路可以增強放療和順鉑的療效［14］。鑒于Shh 信號與宮頸癌的相互作用，因此，本實驗以Hela 細胞為宮頸癌細胞研究對象，抑制Shh 信號通路觀察其對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響以及可能的機制。

本研究結(jié)果顯示，Shh 信號通路抑制劑Cyclopamine 對Hela 細胞有一定的抑制作用，隨著Cyclopamine 濃度增大抑制效果更明顯，這與Shh 蛋白激活Shh 信號通路能夠促進Hela 細胞增長相一致［15］。本實驗與YU等［16］的研究結(jié)果相一致，Cyclopamine 能夠抑制Hela 細胞的增殖，并且具有藥物濃度依賴性，濃度越大抑制情況更加明顯。宮頸癌細胞凋亡途徑包括：（1）Caspase-9/Caspase-3細胞凋亡途徑。Caspase-9 和Caspase-3 凋亡途徑在內(nèi)源性凋亡的過程中扮演重要作用，Caspase-9作為內(nèi)源性凋亡途徑的執(zhí)行者，而Caspase-3 則被認為是凋亡最終執(zhí)行者，因此檢測Caspase-9 和Caspase-3 的表達水平變化可以反映凋亡的發(fā)生。研究［17］顯示來自粉煤灰的沸石X 可以通過激活Caspase-9 和Caspase-3 途徑來誘導(dǎo)宮頸癌細胞進入凋亡狀態(tài)；而在本研究中Cyclopamine 能夠使凋亡相關(guān)因子Caspase-3 和Caspase-9 的表達升高，而且隨著濃度增大，Caspase-3 和Caspase-9 的表達升高也明顯，說明抑制Shh 信號通路能夠激活Caspase-3 和Caspase-9 途徑來誘導(dǎo)細胞凋亡；（2）Bcl-2/Bax 細胞凋亡途徑。SHI 等［18］通過巖白菜素抗癌治療發(fā)現(xiàn)其可以通過上調(diào)Bax 蛋白表達以及下調(diào)Bcl-2 蛋白表達來促使宮頸癌細胞的凋亡；本實驗研究也有相一致的結(jié)果，Cyclopamine 抑制Shh信號通路后能夠使抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下降和促凋亡蛋白Bax 表達上升，而且Bcl-2 表達下降和Bax 表達上升具有Cyclopamine 藥物濃度依賴性，說明抑制Shh 信號也能夠通過Bcl-2/Bax 細胞凋亡途徑來影響細胞凋亡。PCNA 是DNA 聚合酶的輔助因子，不僅在DNA 復(fù)制合成以及細胞周期中起著重要的調(diào)控作用，而且許多細胞內(nèi)外增殖信號都須經(jīng)過PCNA 的參與［19］。PCNA 水平在DNA 合成周期的改變與細胞增殖過程一致，是一種衡量腫瘤惡性程度與增殖力的可靠指標?？吕锢m頸癌Hela 細胞抑制作用也與上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 以及下調(diào)PCNA 蛋白有關(guān)［20］；本研究中，隨著Cyclopamine 的藥物濃度增大，PCNA蛋白表達逐漸下降，PCNA 蛋白表達明顯被抑制，說明Cyclopamine 抑制Shh 信號通路后能通過抑制PCNA 的表達來抑制Hela 細胞DNA 合成及分裂增殖，其可能的機制與通過G0/G1 細胞周期阻滯抑制細胞增殖有關(guān)［8］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cyclopamine 抑制Shh信號通路后，隨著Cyclopamine 藥物濃度增大能夠抑制Hela 細胞增殖，抑制Bcl-2 表達、促進Bax、Caspase-3 和Caspase-9 來誘導(dǎo)細胞凋亡，其可能的機制與PCNA 蛋白表達逐漸下降，抑制Hela 細胞DNA 合成及分裂增殖有關(guān)。本實驗存在一定的局限性，宮頸癌細胞系只研究了一株，需要多研究幾株細胞系保證實驗可靠性，凋亡途徑以及增殖有關(guān)蛋白研究有限，具體機制有待進一步研究查證，以期為宮頸癌的靶向治療提供有益的線索。