李 柳，鄭 喆，吳鳳玉，郝一江，趙 笑，曹永強(qiáng)，余志堅(jiān)，陳 超，楊貞耐,,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 禹城 251200）

甲醇芽孢桿菌凝乳酶是一種具有凝乳作用的微生物蛋白酶[1]。凝乳酶在干酪生產(chǎn)過程中不僅起凝乳作用，還會(huì)影響干酪的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味[2]。小牛皺胃酶因具有高凝乳活性和低非特異性水解活性，所產(chǎn)干酪的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味均符合生產(chǎn)要求[3]，此酶已作為商品凝乳酶用于干酪的生產(chǎn)，但由于生產(chǎn)成本高以及屠宰動(dòng)物引發(fā)的倫理問題[4]，使得尋找小牛皺胃酶代替品顯得尤為重要。植物凝乳酶來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，但植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，凝乳活性低[5]。微生物凝乳酶易提取，酶活力高，逐漸在干酪生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位[6-8]。近年來(lái)隨著干酪需求量的日益增加，人們?cè)絹?lái)越重視微生物凝乳酶及其基因工程酶的研究開發(fā)。大腸桿菌基因克隆原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白具有繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定、外源蛋白表達(dá)量高、易于純化等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，重組表達(dá)出的凝乳酶可用于干酪的制備和酶特性的后續(xù)研究。

蛋白質(zhì)是生物體功能的執(zhí)行者和結(jié)構(gòu)的構(gòu)建者[11-12]，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究一直是生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于技術(shù)手段的限制，利用實(shí)驗(yàn)方法（主要為X-射線晶體衍射、核磁共振）解析蛋白結(jié)構(gòu)投入大、周期長(zhǎng)，此外隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，越來(lái)越多的基因序列可以輕松被找到，這種序列與結(jié)構(gòu)間不平衡的現(xiàn)象極大地限制了對(duì)蛋白質(zhì)功能及其相關(guān)作用機(jī)理的理解。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的在線模擬技術(shù)為蛋白質(zhì)研究提供了一種新手段[13-15]。Singh等[16]通過氨基酸序列預(yù)測(cè)了來(lái)自蠟狀芽孢桿菌的谷氨酰胺酶的3D模型結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該模型的活性位點(diǎn)富含11 個(gè)保守氨基酸殘基，該預(yù)測(cè)結(jié)果針對(duì)結(jié)腸癌（HCT-116）細(xì)胞系確認(rèn)該酶的抗癌活性有一定的指導(dǎo)意義。杭鋒[17]通過Paenibacillus spp. BD3526凝乳酶酶源的編碼基因和氨基酸序列，對(duì)成熟酶進(jìn)行N-端氨基酸測(cè)序，確定了酶源成熟過程中的水解位點(diǎn)，并利用氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)和親緣關(guān)系分析，確定該酶的活性中心位點(diǎn)和酶的分類，基于同源建模方法對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)并對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

為進(jìn)一步了解微生物凝乳酶的結(jié)構(gòu)特性，利用從酒曲中分離純化并獲得氨基酸序列的甲醇芽孢桿菌凝乳酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[18]，將該凝乳酶基因在大腸桿菌中重組表達(dá)，并采用生物信息學(xué)方法研究其結(jié)構(gòu)特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TOP 10克隆菌株、BL21（DE3）表達(dá)菌株 卡梅德生物技術(shù)有限公司；蛋白/DNA Marker 美國(guó)Thermo Fisher公司；Ni Sepharose Fast Flow 美國(guó)GE公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 上海碧云天生物科技公司；瓊脂糖 上?；蚬荆毁|(zhì)粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶/T4 DNA連接酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

LB培養(yǎng)基：10 g NaCl，10 g蛋白胨，5 g酵母浸粉，加去離子水至1 L，調(diào)pH值至7.0～7.2后分裝滅菌。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15～20 g。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 21R臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；雪花狀制冰機(jī) 日本Sanyo公司；PTC-200基因擴(kuò)增儀 美國(guó)MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醇芽孢桿菌凝乳酶基因的合成

通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）檢索到凝乳酶（I3EB99）的氨基酸序列為759 個(gè)氨基酸[18]。根據(jù)此氨基酸序列，在DNAMAN軟件的輔助下推導(dǎo)出該基因的核苷酸序列，并以大腸桿菌密碼子使用頻率為基準(zhǔn)，對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。將優(yōu)化后的基因序列翻譯成氨基酸序列與優(yōu)化前蛋白酶的原始氨基酸序列比對(duì)，確保優(yōu)化前后氨基酸序列保持一致。然后將優(yōu)化后的全基因序列委托卡梅德生物科技有限公司直接進(jìn)行化學(xué)合成，基因序列兩端分別帶有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)。

1.3.2 甲醇芽孢桿菌凝乳酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

1.3.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

化學(xué)合成的甲醇芽孢桿菌凝乳酶全基因序列直接進(jìn)行NcoI-XhoI雙酶切，定向插入pET28a（＋）質(zhì)粒表達(dá)載體，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建pET28a（＋）重組質(zhì)粒。蛋白C端融合6×His標(biāo)簽進(jìn)行表達(dá)純化。

1.3.2.2 TOP10克隆菌株感受態(tài)的制備

取-80 ℃冰凍菌株，用劃線法接種于LB固體中，于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。從平板上挑取單個(gè)菌落接種至含有3 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。取菌液1 mL接種至含有100 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)約2～3 h（200～300 r/min），當(dāng)菌落OD600nm值達(dá)到0.3～0.4時(shí)，將三角瓶取出放于冰上10～15 min，在無(wú)菌條件下把菌液倒入50 mL離心管中，并在4 ℃、4 000 r/min離心10 min，然后棄上清液，將管倒置于濾紙上1 min，吸干殘留的培養(yǎng)液，加入10 mL 0.1 mol/L的CaCl2溶液到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30 min，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液，將管倒置于干濾紙上1 min，吸干殘留的培養(yǎng)液，加4 mL冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2重懸浮菌體，每管0.2 mL分裝，至4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株

構(gòu)建好的pET28a（＋）重組質(zhì)粒表達(dá)載體用無(wú)菌水溶解后取適量與TOP10克隆菌株感受態(tài)混合，冰浴30 min后于42 ℃水浴90 s，立即冰浴2 min。在無(wú)菌條件下加入1 mL LB培養(yǎng)基（按照1∶1 000比例稀釋卡那霉素），37 ℃培養(yǎng)30～60 min后，進(jìn)行涂板，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.3.2.4 重組質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定

挑取pET28a（＋）重組質(zhì)粒單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用NcoI和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將雙酶切鑒定的陽(yáng)性克隆送至卡梅德生物科技有限公司測(cè)序，通過DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化后的甲醇芽孢桿菌凝乳酶全基因序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全正確的重組質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體。

1.3.3 重組甲醇芽孢桿菌凝乳酶的表達(dá)純化

1.3.3.1 pET28a（＋）-I3EB99轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta

將質(zhì)粒1 μL加入到100 μL感受態(tài)細(xì)菌中，置冰上20 min，42 ℃熱激90 s，迅速置冰中5 min再加入600 μL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min振搖1 h。離心后全部涂布于含50 μg/mL Kan＋的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。

1.3.3.2 IPTG誘導(dǎo)pET28a（＋）-I3EB99融合蛋白的表達(dá)

挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50 μg/mL Kan＋的10 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37 ℃、220 r/min振搖12 h。次日向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃、220 r/min振搖4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min條件下室溫離心2 min，棄上清液，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀并直接100 ℃煮樣10 min后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），挑選誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的克隆按1∶100接種于50 μg/mL Kan＋的1～2 L LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min振搖至菌體OD600nm值為0.6～0.8時(shí)向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，37 ℃、220 r/min振搖4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

1.3.3.3 pET28a（＋）-I3EB99融合蛋白的純化

誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的菌液在4 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體棄上清液，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體再次離心收集菌體，將0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液重懸液進(jìn)行超聲波破碎后按1∶1 000的比例加入cocktail，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液。

利用低壓層析系統(tǒng)，以0.5 mL/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析系柱。用Ni-IDA Binding-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以0.5 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280nm值達(dá)到基線；用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280nm值達(dá)到基線；用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）進(jìn)行透析12 h。

1.3.4 凝乳活力的測(cè)定

采用Arima等[19]方法。將脫脂乳溶解在濃度為0.01 mol/L的CaCl2溶液中制成10%的脫脂乳溶液，室溫靜置30 min后各量取5 mL分裝到小試管中，于35 ℃恒溫水浴箱中保溫5 min，在35 ℃取重組表達(dá)的酶液0.5 mL加入到5 mL裝有10%脫脂乳溶液的試管中，搖勻后開始計(jì)時(shí)，當(dāng)開始出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)立即停止計(jì)時(shí)。凝乳活力計(jì)算如式（1）所示：

式中：V1為脫脂牛奶溶液體積/mL；t為凝乳時(shí)間/s；V2為所加酶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 金屬離子對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶凝乳活力的影響

為確定不同金屬離子對(duì)凝乳酶凝乳活力的影響，分別用含有50 mmol/L的K＋、Na＋、Mg2＋、Zn2＋、Al3＋、Cu2＋、Fe2＋、Ca2＋溶液溶解凝乳酶，以去離子水為空白對(duì)照，25 ℃孵育30 min，分別按照1.3.4節(jié)方法測(cè)定凝乳活力。

1.3.6 蛋白水解活力的測(cè)定

根據(jù)張富新[20]的福林-酚試劑法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取酪蛋白1.0 g用濃乳酸潤(rùn)濕后，加入pH 3.0的乳酸緩沖液80 mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌直至完全溶解，冷卻后用乳酸緩沖液稀釋至100 mL，即為10 g/L的酪蛋白溶液。

取1 mL酶液于試管中，40 ℃保溫2 min，加入10 g/L酪蛋白1 mL，搖勻后在相同溫度下保溫10 min，再加入0.4 mol/L三氯乙酸溶液2 mL，搖勻終止反應(yīng)并取出靜置10 min，過濾后加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL，福林試劑使用液1 mL，置于40 ℃水浴中顯色20 min，取出于波長(zhǎng)680 nm測(cè)定其吸光度，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.009 5X＋0.002 3。蛋白水解活力計(jì)算如式（2）所示：

式中：A為樣品吸光度；K為吸光常數(shù)；4為反應(yīng)試劑總體積4 mL；10為反應(yīng)時(shí)間10 min；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.7 重組甲醇芽孢桿菌凝乳酶質(zhì)量濃度測(cè)定

凝乳酶含量采用Easy II Protein Quantitative Kit BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定[21]，實(shí)驗(yàn)步驟參照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行：1）先將solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按solution A、solution B試劑體積比50∶1配制成BCA工作液，充分混勻；2）標(biāo)準(zhǔn)品的制備：完全溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg/mL BSA，-20 ℃保存）按照說明書進(jìn)行稀釋；3）凝乳酶樣品的制備：將凝乳酶樣品進(jìn)行稀釋；4）將配備好后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品每孔25 μL加入96 孔板中，并做復(fù)孔；5）每孔加入200 μL工作液，振蕩混勻30 s；6）將酶標(biāo)板37 ℃孵育30 min；7）冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A562nm；8）根據(jù)說明書，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定凝乳酶終質(zhì)量濃度。

1.3.8 SDS-PAGE分析

按照朱廣廉等[22]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[23]

分別對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶的親/疏水性（http://web.expasy.org/protscale/）、跨膜特性（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、信號(hào)肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和二級(jí)結(jié)構(gòu)（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行預(yù)測(cè)。

登錄PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www.rcsb.org/pdb/home/home.do）檢索甲醇芽孢桿菌凝乳酶的同源蛋白質(zhì)，作為其三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)模板，登錄SWISS -MODEL在線網(wǎng)址（http://www.swissmodel.expasy.org/），選擇Alignment Mode模式，分別上傳凝乳酶的氨基酸序列和模板蛋白的氨基酸序列，對(duì)凝乳酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用Swiss-Pdb Viewer（https://spdbv.vital-it.ch/）對(duì)建立的模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇芽孢桿菌凝乳酶基因的密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)與全基因合成

圖1 甲醇芽孢桿菌凝乳酶基因的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of MCE gene from B. methanolicus

按照所選宿主菌大腸桿菌的密碼子使用頻率、密碼子分布和GC含量對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。優(yōu)化后的凝乳酶基因所含密碼子大部分由大腸桿菌偏愛密碼子構(gòu)成而很少含有稀有密碼子，并按照大腸桿菌密碼子的使用頻率進(jìn)行分布，此外優(yōu)化后的GC含量為47%，這有利于基因的直接合成（圖1A）。通過化學(xué)合成獲得了優(yōu)化后的甲醇芽孢桿菌凝乳酶全基因序列（圖1B）。將優(yōu)化后的凝乳酶全基因序列通過DNAMAN軟件翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，與NCBI中初始的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)，優(yōu)化前后氨基酸序列完全一致。

2.2 甲醇芽孢桿菌凝乳酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

甲醇芽孢桿菌凝乳酶全基因和表達(dá)載體pET28a（＋）經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切并通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a（＋）-I3EB99，然后轉(zhuǎn)化到TOP10克隆菌株中發(fā)酵培養(yǎng)后用NcoI和XhoI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有2 條電泳條帶（圖2A），其大小剛好與5 369 bp長(zhǎng)度的載體片段及2 214 bp長(zhǎng)度的目的片段相符，表明目的基因片段已成功連接到表達(dá)載體上。

將雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送至卡梅德生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，然后將重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與甲醇芽孢桿菌凝乳酶的基因序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化后的基因序列完全一致，部分比對(duì)結(jié)果見圖2B，說明插入的目的基因序列正確，重組表達(dá)載體pET28a（＋）-I3EB99已構(gòu)建成功。

圖2 甲醇芽孢桿菌凝乳酶重組表達(dá)載體的鑒定Fig. 2 Identification of recombinant expression vector

2.3 甲醇芽孢桿菌凝乳酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 為重組表達(dá)載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的SDSPAGE圖，與未誘導(dǎo)相比，分子質(zhì)量為80.34 kDa的甲醇芽孢桿菌凝乳酶在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，挑選表達(dá)成功的甲醇芽孢桿菌凝乳酶的克隆子在發(fā)酵液中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白大量表達(dá)。

圖3 甲醇芽孢桿菌凝乳酶誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE pattern showing induced expression of MCE

2.4 重組甲醇芽孢桿菌凝乳酶的分離純化

圖4 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的純化結(jié)果Fig. 4 Purification of recombinant MCE from B. methanolicus

表1 不同金屬離子對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶凝乳活性的影響Table 1 Effect of different metal ions on recombinant MCA

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白pET28a（＋）-I3EB99在低溫條件下通過鎳柱進(jìn)行分離純化，收集洗脫液濃縮透析后對(duì)各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咪唑濃度為150 mmol/L時(shí)蛋白洗脫效果最好（圖4A），但經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為80.34 kDa的目標(biāo)凝乳酶在純化后的SDS-PAGE結(jié)果中存在分子質(zhì)量約為45 kDa和35 kDa的兩個(gè)小分子蛋白，且二者分子質(zhì)量總和為目標(biāo)凝乳酶分子質(zhì)量。因此可推測(cè)目標(biāo)凝乳酶在純化洗脫過程中可能發(fā)生了自身剪切，自主降解為兩個(gè)小分子蛋白，最終得到的是3 個(gè)蛋白混合物，加入蛋白酶抑制劑cocktail后自身降解現(xiàn)象可被部分抑制，有文獻(xiàn)報(bào)道指出，乙二胺四乙酸的存在可完全抑制蛋白酶的自身降解[24]，但同時(shí)也會(huì)使酶活完全損失。一般而言內(nèi)源蛋白的產(chǎn)生和降解都維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，因此在穩(wěn)定的環(huán)境因素下細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量也是穩(wěn)定的[25]，但是在體外研究中，蛋白合成過程終止，從而降解大大增強(qiáng)。得到的該蛋白組分只有溶解在含50 mmol/L的Mg2＋溶液中時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝乳效果（表1），且具有凝乳活性的蛋白酶組分質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果為0.70 mg/mL，凝乳活力為（15 870±1.17）SU/g，蛋白水解活力為（263.81±0.94）U/g，即凝乳活力/蛋白水解活力（C/P）值為60.16，與文獻(xiàn)中已報(bào)道的C/P值為80.45[26]相接近。該酶溶解在其他金屬離子溶液中的蛋白酶不具有凝乳能力，說明此凝乳酶的凝乳活力可通過Mg2＋進(jìn)行活化。待蛋白酶完全降解后得到2 個(gè)小分子蛋白后（圖4B），喪失了凝乳能力，說明該蛋白酶在分離純化的同時(shí)會(huì)發(fā)生自我斷裂使保持其具有凝乳活性的蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞。將分離純化后具有凝乳活性的凝乳酶放在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 重組甲醇芽孢桿菌凝乳酶的結(jié)構(gòu)特性

2.5.1 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過在http://web.expasy.org/protscale/中對(duì)凝乳酶的親/疏水性對(duì)比結(jié)果表明，甲醇芽孢桿菌凝乳酶具有很強(qiáng)的疏水性，在圖5A中表現(xiàn)為負(fù)值，疏水性有利于蛋白質(zhì)向內(nèi)部折疊形成兩親性α-螺旋或β-折疊，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在很大程度上有賴于分子內(nèi)的疏水作用。甲醇芽孢桿菌凝乳酶的這一特性與周筠梅等[27]報(bào)道的胰凝乳蛋白酶強(qiáng)疏水性保持一致。圖5B顯示該凝乳酶含有少量跨膜區(qū)蛋白（膜蛋白），大部分蛋白位于膜外側(cè)，膜蛋白是蛋白酶的催化組分，由疏水區(qū)組成，以α-螺旋形式存在，位于胞質(zhì)內(nèi)，可形成有生物功能的二聚體[28]。從圖5C可以看出，凝乳酶的信號(hào)肽位于前30 個(gè)氨基酸，信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，是在新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端的氨基酸序列[29]。外源蛋白在宿主菌，如大腸桿菌中的表達(dá)形式多為細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)即容易形成包涵體，少數(shù)為細(xì)胞外分泌表達(dá)，利用信號(hào)肽引導(dǎo)外源蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間，提高可溶性，可避免因包涵體復(fù)性帶來(lái)的困難[30-31]。在甲醇芽孢桿菌凝乳酶的重組表達(dá)中，凝乳酶基因連接上信號(hào)肽后在大腸桿菌中得到了分泌表達(dá)。圖5D顯示甲醇芽孢桿菌凝乳酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲，其中α-螺旋在二級(jí)結(jié)構(gòu)中起主要的穩(wěn)定作用[32]，結(jié)果顯示該凝乳酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯少于β-折疊結(jié)構(gòu)，可能這是此凝乳酶在分離純化過程中易降解的原因。

圖5 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Structural analysis of recombinant MCE from B. methanolicus

2.5.2 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的序列鑒定

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)凝乳酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，選擇序列同源性相似度高的蛋白質(zhì)構(gòu)建了發(fā)育樹[33]（圖6A），發(fā)現(xiàn)凝乳酶的同源蛋白為hypothetical protein Bacillus methanolicus，且序列相似度為100%。進(jìn)一步對(duì)這2 種蛋白的氨基酸進(jìn)行全序列比對(duì)，圖6B顯示這2 種蛋白質(zhì)氨基酸序列完全一致。甲醇芽孢桿菌凝乳酶的同源蛋白為來(lái)自甲醇芽孢桿菌的一種未知蛋白，也進(jìn)一步說明了甲醇芽孢桿菌凝乳酶是一種未知蛋白酶，有廣闊的研究開發(fā)前景。

圖6 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的同源性分析Fig. 6 Homology analysis of recombinant MCE from B. methanolicus

2.5.3 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)

通過SWISS-MODEL同源建模的方法確定凝乳酶在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的模板蛋白2ra1.1.A，序列相似度為30.93%，有文獻(xiàn)指出相似度大于30%即可用同源建模的方法進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[34]，因此該方法適用于甲醇芽孢桿菌凝乳酶，且GMQE值為0.13，介于0～1之間，QMEAN值為-2.64均說明該模型擬合良好。進(jìn)一步用Ramachandran圖[35]對(duì)模型的可靠性進(jìn)行評(píng)估，94.09%的氨基酸落入核心區(qū)，說明構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)二面角分布和立體構(gòu)象均較為合理，符合立體化學(xué)二面角分布的要求，通過模型評(píng)估數(shù)據(jù)證明該模型可靠。最終得到的甲醇芽孢桿菌凝乳酶的三維結(jié)構(gòu)模型如圖7A所示。

蛋白質(zhì)主要由碳、氫、氧、氮等化學(xué)元素組成，是一類重要的生物大分子。蛋白質(zhì)維持自身穩(wěn)定需要正確折疊為一個(gè)特定構(gòu)型，主要通過大量的非共價(jià)鍵相互作用（氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水作用）實(shí)現(xiàn)，此外在一些蛋白質(zhì)折疊中，一些二硫鍵也起到關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步研究甲醇芽孢桿菌凝乳酶的三維結(jié)構(gòu)特性，利用Swiss-Pdb Viewer對(duì)其原子構(gòu)成、氫鍵分布和分子表面的電勢(shì)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中圖7B為甲醇芽孢桿菌凝乳酶的原子分布情況，碳原子、氫原子、氧原子、氮原子共同形成了凝乳酶的結(jié)構(gòu)，包括氨基、羧基以及進(jìn)一步盤曲折疊形成的多肽鏈等，是必不可少的一部分。圖7C為凝乳酶分子表面所形成的氫鍵，在二級(jí)結(jié)構(gòu)如α-螺旋和β-折疊片中，氫鍵廣泛存在并形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[36]，從而起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。圖7D為凝乳酶分子表面的靜電勢(shì)分布情況，凝乳酶的分子表面幾乎全被高電勢(shì)籠罩，使凝乳酶得到很好保護(hù)，利于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，靜電勢(shì)高還可在蛋白互作研究中大大提高分子對(duì)接的效率和準(zhǔn)確性[37]。

圖7 甲醇芽孢桿菌凝乳酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 7 Advanced structural prediction of recombinant MCE from B. methanolicus

3 結(jié) 論

本研究通過基因工程實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)出甲醇芽孢桿菌凝乳酶，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)該凝乳酶保持其具有凝乳活性的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在分離純化過程中發(fā)生自我剪切主動(dòng)降解為2 個(gè)小分子蛋白且完全降解后喪失凝乳活性，這與該凝乳酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量較少相吻合。此外該凝乳酶具有很強(qiáng)的疏水性，存在跨膜蛋白和信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，并且與來(lái)自甲醇芽孢桿菌的hypothetical protein具有同源性且氨基酸序列完全一致，SWISS-MODEL同源建模方法成功確定了甲醇芽孢桿菌凝乳酶在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的模板蛋白2ra1.1.A。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究甲醇芽孢桿菌凝乳酶的作用機(jī)制和功能特性提供了良好的分析依據(jù)。