杭天宇，宋前進(jìn)，金 銘，關(guān)平原，溫永俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人獸共患病，以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征，嚴(yán)重威脅著人類和許多動(dòng)物的生命健康，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅[1]。布魯氏菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的小球桿狀菌，革蘭氏染色陰性，屬于α-2蛋白細(xì)菌家族，能夠感染專職和非專職巨噬細(xì)胞[3-5]。密度感應(yīng)系統(tǒng)（qurum sensing，QS）是細(xì)菌的一種通訊系統(tǒng)，通過散在的細(xì)胞間信號(hào)分子產(chǎn)物介導(dǎo)細(xì)胞間通訊來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與布魯氏菌[6]以及其他多種致病菌[7-8]毒力有關(guān)。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，VjbR是密度感應(yīng)系統(tǒng)Lux R 蛋白家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠影響IV 型分泌系統(tǒng)（T4SS）和鞭毛基因表達(dá)，并且在布魯氏菌毒力和胞內(nèi)寄生中發(fā)揮了重要作用。

Fuqua 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Lux R 蛋白家族可以調(diào)節(jié)革蘭氏陰性菌密度感應(yīng)系統(tǒng)中酰化高絲氨酸內(nèi)酯類（AHLs）信號(hào)分子自誘導(dǎo)，使細(xì)菌和細(xì)胞產(chǎn)生密度依賴，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。值得注意的是，Kleinman 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，VjbR 與其他Lux R 型蛋白不同，并不介導(dǎo)集體反應(yīng)，而是在細(xì)胞早期感染階段，將單個(gè)細(xì)菌隔離在吞噬體中。

為此，本試驗(yàn)通過成功構(gòu)建pET-30a-VjbR 原核表達(dá)載體，將VjbR基因進(jìn)行原核表達(dá)及純化、生物信息學(xué)分析，探索該蛋白的免疫原性，為日后該基因的單克隆抗體制備及iELISA 診斷試劑盒的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與陽性血清

羊種布魯氏菌Rev.1株核酸：內(nèi)蒙古金宇保靈生物藥品有限公司惠贈(zèng)；大腸桿菌BL21（DE3）菌株、DH5α 菌株及pET-30a 載體：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；布魯氏菌陽性血清：購自美國(guó)IDEXX 生物科技有限公司。

1.2 試劑

DNA Marker：購自北京天根生化科技有限公司；T4連接酶：購自NEB（北京）有限公 司；限制性內(nèi)切酶（BamHI/XhoI）、2×EsTaqMasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及細(xì)菌質(zhì)粒小提取試劑盒、顯色劑：購自Thermo Fisher Scientific 公司；HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 抗體：購自Abcom 公司；蛋白Marker：購自北京索萊寶科技有限公司；

1.3 引物

根據(jù)GenBank 中收錄的布魯氏菌VjbR基因序列設(shè)計(jì)引物，并由吉林省庫美科技有限公司合成。

1.4 主要儀器

PCR 儀、超凈工作臺(tái)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、超速離心機(jī)、制冰機(jī)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、蛋白純化儀等，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 目的基因擴(kuò)增

VjbR基因PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、DNA 模板2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min 30 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用DNA 回收試劑盒回收目的片段，并與pMD19-T 載體連接，條件為16 ℃ 8 h；將構(gòu)建好的pMD19-T-VjbR 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，活化后在具有氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基中篩選；PCR鑒定陽性菌液送生工生物工程有限公司測(cè)序，在GenBank 中比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用BamHI 和XhoI 核酸內(nèi)切酶，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-vjbR 和pET-30a 原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別進(jìn)行DNA 回收；使用T4連接酶16 ℃連接8 h，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞；活化后在具有卡那抗性的LB 固體培養(yǎng)基中篩選，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI 和XhoI 雙酶切鑒定。

1.7 重組蛋白原核表達(dá)及SDS-PAGE 電泳檢測(cè)

從轉(zhuǎn)化后涂板的LB 固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆菌落至10 mL 含卡那抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培 養(yǎng)12 h；取1 mL 菌 液至100 mL 含卡那抗性LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD=0.6～0.8；加入100 mmol/L 的IPTG 至終濃度0.5 mmol/L，37 ℃，200 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h；將誘導(dǎo)表達(dá)后菌液以12 000 r/min 離心15 min，然后超聲破碎菌體（工作循環(huán)40%、超聲5 s、間歇5 s、破碎30 min），12 000 r/min 離心15 min；分離上清與沉淀，將沉淀用20～30 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液重懸；取上清和重懸后菌液各10 μL 至兩個(gè)全新1.5 mL 離心管中，加入等體積的2×loading buffer 蛋白上樣緩沖液中，100 ℃ 10 min，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。

1.8 重組蛋白純化

用梯度離心法，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。用15 mL 10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）溶液重懸沉淀后，加入5% Triton X-100，旋渦震蕩充分混勻后靜置10 min，12 000 r/min，離心10 min，分離上清和沉淀；棄上清，用15 mL 10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）溶液重懸沉淀，12 000 r/min，離心10 min，棄上清。重復(fù)此步驟1次。用10 mL 10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）溶液重懸沉淀，加5～10 mL 含8 mol/L 尿素的10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）溶液，過夜溶解蛋白；次日12 000 r/min，離心10 min，收集上清；取10 μL 上清液加入40 μL 的5×loading buffer 蛋白上樣緩沖液中，100 ℃ 10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.9 重組蛋白Western-blot 檢測(cè)

將純化后的蛋白SDS-PAGE 電泳分析后，14 V 50 min 轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用5%的脫脂乳，4 ℃封閉轉(zhuǎn)印后的PVDF 膜8～10 h；用PBST 緩沖液洗滌3次，每次15 min；將PVDF 膜置于標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌陽性血清與5%脫脂乳稀釋液中（稀釋比例1：50），37 ℃孵育4 h；用PBST 緩沖液洗滌3次，每次15 min；加入1：8 000稀釋的兔抗羊IgG 抗體（HRP 標(biāo)記），37 ℃孵育2 h；用PBST 緩沖液洗滌3次，每次15 min，用顯色劑顯色拍照。

1.10 生物信息學(xué)分析

用TMHMM Serverv 2.0軟件，預(yù)測(cè)VjbR 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；用SignalP 5.0 Server 軟件，預(yù)測(cè)VjbR 蛋白的信號(hào)肽；通過SOPMA 軟件，分析VjbR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過Phyre2軟件，預(yù)測(cè)VjbR 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Predicting Antigenic Peptides 軟件，預(yù)測(cè)VjbR 蛋白的抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 目的片段擴(kuò)增及原核質(zhì)粒構(gòu)建

羊種布魯氏菌Rev.1株VjbR基因片段大小為789 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期大小一致（圖1）。將重組質(zhì)粒用BamHI 和XhoI 進(jìn)行酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖1 VjbR 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒BamHI 和XhoI 雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組蛋白SDS-PAGE 電泳檢測(cè)

取經(jīng)破碎處理的樣品，進(jìn)行上樣電泳檢測(cè)。SDS-PAGE 分析顯示，VjbR基因在34 kD 處有明顯條帶（圖3、圖4），主要表達(dá)在沉淀中，且大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 SDS-PAGE 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)純化

圖4 重組蛋白在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)情況的SDS-PAGE 分析結(jié)果

對(duì)沉淀樣品依次用15、20、10 mL 含10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液重懸沉淀，12 000 r/min，分別離心15 min，再加5 mL 含8 mol/L 尿素的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白，12 000 r/min 離心10 min，收集上清。對(duì)收集的上清，用SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白純化效果，證實(shí)純化出相應(yīng)的蛋白（圖5）。

圖5 目的蛋白純化后的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果

2.4 Western-blot 檢測(cè)

將純化后的重組蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠至于14 V 電壓下轉(zhuǎn)印50 min，孵育布魯氏菌陽性血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯的目的條帶，證實(shí)重組蛋白具有一定的反應(yīng)原性，且大小與預(yù)期大小相符（圖6）。

2.5 目的蛋白生物信息學(xué)分析

圖6 Western-blot 檢測(cè)結(jié)果

通過TMHMM Serverv.2.0軟件，分析羊種布魯氏菌VjbR 蛋白氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)（圖7）；利用SignalP 5.0 Server軟件，預(yù)測(cè)羊種布魯氏菌的VjbR 蛋白的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽（圖8）；利用Predicting Antigenic Peptides 軟件，預(yù)測(cè)羊種布魯氏菌的VjbR 蛋白的抗原決定簇，可發(fā)現(xiàn)該蛋白共有15個(gè)抗原決定簇（圖9）。

圖7 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖8 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

圖9 抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

經(jīng)SOPMA 軟件分析得出，該蛋白中參與形成α-螺旋的氨基酸有131個(gè)，占比為49.81%；參與延伸鏈形成的氨基酸有34個(gè)，占比為12.93%；參與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的氨基酸有85個(gè)，占比為32.32%；參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸有13個(gè)，占比為4.94%（圖10）。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)含多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元且有明顯的折疊層次。通過軟件Swiss Model 預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)中有大量的α-螺旋及相應(yīng)的無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖11）。

圖10 VjbR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖11 VjbR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

布魯氏菌病流行范圍廣，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成巨大威脅。Li 等[12]研究表明，缺失VjbR基因的羊種布魯氏菌16M突變株在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)毒力減弱。Tafelmeyer 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，VjbR基因參與調(diào)節(jié)脂多糖的合成和釋放，還能調(diào)節(jié)幾種外膜蛋白的合成。這幾種外膜蛋白與布魯氏菌毒力有關(guān)。因此，VjbR基因在布魯氏菌致病力中占有重要地位。該基因的研究對(duì)布魯氏菌相關(guān)致病機(jī)制的研究提供了材料。屈海龍等[14]在布魯氏菌研究中發(fā)現(xiàn)，自然感染布魯氏菌的牛、羊血清中含有VjbR 蛋白抗體，可知VjbR 蛋白廣泛存在于布魯氏菌病患病動(dòng)物中，因此對(duì)VjbR 蛋白的深入研究具有一定意義。然而，人們目前多關(guān)注于VjbR基因的毒力研究，而關(guān)于VjbR基因的原核表達(dá)與蛋白純化研究則很少。

本試驗(yàn)應(yīng)用TMHMM Serverv.2.0在線軟件等生物信息學(xué)軟件，對(duì)VjbR基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌Rev.1株的VjbR 蛋白無跨膜區(qū)，無信號(hào)肽；利用Predicting Antigenic Peptides 在線軟件分析Rev.1株的VjbR 蛋白抗原表位發(fā)現(xiàn)，該蛋白共有15個(gè)抗原決定簇。利用軟件Swiss Model 構(gòu)建了VjbR 蛋白的三維模型，從而有利于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的可視化分析。

本研究通過成功構(gòu)建羊種布魯氏菌pET-30a-VjbR 原核表達(dá)載體，使VjbR 蛋白得到大量表達(dá)，并通過純化，得到了高度純化的重組蛋白。同時(shí)其反應(yīng)原性鑒定和生物信息學(xué)分析結(jié)果，為進(jìn)一步研究該基因編碼蛋白在臨床診斷與治療中的作用提供了重要依據(jù)。