繩秀珍，李文濤，王欣欣，唐小千，邢 婧，戰(zhàn)文斌，2

（1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動物病害與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071）

弧菌隸屬于弧菌科弧菌屬（Vibrio），是一類革蘭氏陰性菌，可引起海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經(jīng)濟(jì)動物的流行性和暴發(fā)性死亡，已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，給海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。已報(bào)道的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌有20多種，其中副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等是海水養(yǎng)殖動物尤其是魚類弧菌病的主要致病菌[2]，并且常出現(xiàn)多種弧菌的混合感染[3]。常規(guī)技術(shù)每次只能檢測單一病原，因而不能全面反映病害發(fā)生的原因，這不利于疾病的有效防治，因此迫切需要多病原高通量同步檢測技術(shù)。免疫芯片技術(shù)的基本原理是將抗體或抗原固定在芯片載體上制備微陣列，檢測樣品中相對應(yīng)的抗原或抗體，近年來已開始大量應(yīng)用于人類病原和藥物殘留的高通量檢測，具有多靶標(biāo)、高通量、并行分析等優(yōu)勢，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

細(xì)菌是由多種抗原成分組成的復(fù)合體。其抗原組分包括菌體抗原、鞭毛抗原、莢膜抗原和菌毛抗原等，能夠誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生抗體，因而可以利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行病原檢測或血清學(xué)診斷。但是，各病原菌之間常具有共同的抗原性蛋白，導(dǎo)致不同菌之間存在交叉免疫反應(yīng)性，因此排除其他菌的交叉反應(yīng)對結(jié)果準(zhǔn)確判定的干擾是免疫學(xué)技術(shù)需要解決的關(guān)鍵問題[4]。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測診斷技術(shù)可以通過篩選病原菌的特異性抗原或者抗體來避免交叉反應(yīng)，但是費(fèi)時費(fèi)力。本課題組前期曾優(yōu)化了免疫芯片基片制備技術(shù)和反應(yīng)條件[5-6]，制備了同步檢測魚類鰻弧菌、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、熒光假單胞菌（Psedomonas fluorescens）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）及海分支桿菌（Mycobacterium marinum）6種病原菌的抗體芯片[7]，在不篩選病原菌的特異性抗原及抗體情況下，實(shí)現(xiàn)了6種病原菌的同步準(zhǔn)確檢測。

本研究針對魚腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌（Vibrio fluvialis）和哈維氏弧菌等魚類致病性弧菌，提取其菌體蛋白、鞭毛蛋白、外膜蛋白（OMP）和胞外產(chǎn)物（ECP），分析抗原組分的抗原性及其與 6種弧菌的牙鲆抗血清的交叉反應(yīng)性，構(gòu)建了6種弧菌血清學(xué)診斷抗原芯片，并將其應(yīng)用于牙鲆（Paralichthys olivaceus）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）弧菌病的診斷，以期為魚類弧菌病的血清學(xué)診斷和疫苗免疫效果評價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚、菌株與抗體

健康牙鲆：購自山東省某養(yǎng)殖場（體質(zhì)量20～27 g），于實(shí)驗(yàn)室水族箱中暫養(yǎng)7 d，連續(xù)充氣，水溫控制在20 ℃左右，日投喂商品魚飼料1次，換水吸污2次。

鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌以及河流弧菌：由本實(shí)驗(yàn)室保存。將各弧菌活化，分別劃線培養(yǎng)于2216E固體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h；用0.01 mol/L 無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗下菌體，4 ℃條件下8 000×g離心15 min，洗滌3次；無菌PBS 重懸，將濃度調(diào)整為1×108cfu/mL，4 ℃冰箱保存。

牙鲆抗淋巴囊腫病毒血清[8]及鼠抗牙鲆IgM單抗2D8[9]：由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 弧菌抗原組分制備

使用Sarkosyl 法[10]提取6種弧菌的外膜蛋白：首先將菌懸液4 ℃、3 000×g離心20 min，0.02 mol/L Tris-HCl（pH8.0）重懸沉淀，超聲破碎4 min（振幅39%、脈沖3 s、間隔3 s）；4 ℃條件下，將菌液3 000×g離心10 min、23 000×g離心30 min；向沉淀中加入0.1 mL 重蒸水，0.015 mol/L Tris-HCl 0.4 mL（pH7.6，含2.25%十二烷基肌氨酸鈉），0.01mol/L Tris-HCl 1.4 mL（pH7.6，含1.5%十二烷基肌氨酸鈉）重懸；32 ℃水浴30 min，23 000×g離心30 min，用0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.4）重懸，再經(jīng)23 000×g離心30 min后，0.01 mol/L PBS重懸，即為外膜蛋白樣品。

采用平板玻璃紙法[11]提取胞外產(chǎn)物，將6種弧菌的菌懸液轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，在2216E平板上鋪設(shè)一層無菌玻璃紙，取0.2 mL 菌液均勻涂布在玻璃紙上，28 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h；用3 mL 無菌PBS（pH7.4）洗脫收集每個平板的菌體，4 ℃條件下7 000×g離心30 min；將上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，再加入硫酸銨鹽析，將終濃度調(diào)整為2.0 mol/L，室溫下攪拌1 h，然后4 ℃沉降過夜；次日，4 ℃條件下10 000×g離心1 h，使用無菌PBS 重懸沉淀，再以PBS 透析24 h，即獲得胞外產(chǎn)物。

采用酸化高速離心法[12]提取鞭毛蛋白，將6種弧菌懸液于1 500×g離心30 min，收集菌體，使用10 mL 生理鹽水重懸；用1 mol/L HC1將pH調(diào)整為2.0，室溫下攪拌30 min 后，1 500×g離心30 min；將上清液再經(jīng)53 300×g離心1 h，用1 mol/L NaOH 將pH 調(diào)整為7.2，加入硫酸銨至濃度為2.67 mol/L，于4 ℃沉降過夜；次日，53 300×g離心15 min 后，將沉淀溶于2 mL 的0.01 mol/L PBS 中。

全菌蛋白采用各弧菌的破碎液，將菌液置于超聲波破碎儀中低溫破碎4 min，得到的菌懸液即為全菌蛋白。

獲得上述各抗原蛋白后，用Bradford 法[13]測定蛋白含量。

1.3 牙鲆抗血清制備及效價(jià)測定

1.3.1 牙鲆抗血清制備將6種弧菌分別使用0.5%～1.0%的甲醛滅活，4 ℃條件下水平振蕩48 h；用無菌PBS 清洗細(xì)菌，4 ℃條件下8 000×g離心15 min，棄上清，重復(fù)3次；用無菌PBS 重懸沉淀，調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；取0.2 mL 菌液涂于2216E 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，如無細(xì)菌生長則表明滅活成功；將牙鲆分為7組，每組30尾；將1×108cfu/mL 的6種滅活弧菌懸液與弗氏完全佐劑混勻（2：1，v/v），腹腔注射牙鲆作為6個試驗(yàn)組，每尾注射0.2 mL；腹腔注射同量PBS 作為對照組，2周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射弧菌懸液與弗氏不完全佐劑混合液（2：1，v/v），每尾0.2 mL；1周后，將牙鲆麻醉進(jìn)行尾靜脈采血，室溫下傾斜放置1 h，然后4 ℃冰箱過夜；次日，4 ℃條件下10 000×g離心20 min，取上清液即為牙鲆抗血清。連續(xù)采血8周，血清保存于-80 ℃冰箱備用，同時抽取對照組牙鲆血清。

1.3.2 ELISA 檢測牙鲆血清特異性IgM 水平變化在96孔酶標(biāo)板中，加入6種弧菌懸液（100 μL/孔），4 ℃包被過夜，然后使用PBST（含吐溫-20的PBS 緩沖液）洗3次，每次5 min；使用無菌PBS配制的3%牛血清白蛋白（BSA）于37 ℃封閉1 h，再加入不同時間點(diǎn)的牙鲆抗血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL 牙鲆IgM 單抗2D8，37 ℃孵育1 h，然后加入100 μL 堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1：5 000），37 ℃孵育45 min；每孔加入100 μL 對硝基苯磷酸脂應(yīng)用液避光發(fā)色5～30 min，再加入50 μL 2 mol/L NaOH 終止反應(yīng)，穩(wěn)定3～5 min 后，在405 nm 工作波長下測定OD 值。使用未免疫血清代替牙鲆抗血清作為陰性對照，計(jì)算陽性血清與陰性血清光吸收值之比（P/N），P/N≥ 2.1時為陽性。

1.4 牙鲆IgM 單抗標(biāo)記

按照Glue 活化辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記試劑盒的說明，標(biāo)記牙鲆IgM 單抗2D8；利用Bradford 法測定抗體濃度后，以試劑Ⅰ將抗體濃度調(diào)整為1 mg/mL，然后轉(zhuǎn)入試劑Ⅱ活化辣根氧化物酶；4 ℃下離心，使辣根過氧化物酶沉到管底，用試劑Ⅲ將pH 調(diào)整為9.5，4 ℃過夜后，加入試劑Ⅳ10 μL，混勻15 min，終止反應(yīng)；使用1 mol/L HCl將酶標(biāo)抗體的pH 調(diào)為7.0，加甘油至50.0%，-20 ℃保存。

1.5 芯片基片制備

使用前期建立的方法[5]制備抗原芯片基片。首先用洗液將載玻片浸泡過夜，用雙蒸水沖洗至中性，晾干；配制1.2%的瓊脂糖溶液，吸取2 mL于預(yù)熱的載玻片上，均勻覆蓋，待瓊脂糖凝固后，于37 ℃烘箱中干燥。使用前，在室溫下將芯片基片用0.02 mol/L NaIO4溶液活化處理30～60 min，使瓊脂糖表面醛基化，然后用超純水洗3遍，干燥后室溫保存。

1.6 抗原性分析

用無菌PBS 配制的40.0%～50.0%甘油，調(diào)整各抗原組分濃度至1.0 mg/mL；室溫下用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于芯片基片上，37 ℃固定2 h，PBST 洗3次，每次5 min。設(shè)置牙鲆抗淋巴囊腫病毒血清作為陽性對照，PBS 配制的50.0%甘油作為陰性對照。晾干后，用3.0% BSA 封閉1 h，PBST 洗3次；然后分別滴加6種弧菌的牙鲆抗血清，37 ℃孵育1 h，再滴加HRP 標(biāo)記的牙鲆IgM 單抗2D8（1：2 000），37 ℃孵育1 h；用PBST 洗3次，TMB 發(fā)色液避光發(fā)色5～20 min，使用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，超純水洗3次后，用芯片掃描儀記錄結(jié)果。

1.7 牙鲆抗血清與弧菌抗原組分交叉反應(yīng)分析

將6種弧菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白和全菌蛋白分別包被酶標(biāo)板，按照上述ELISA技術(shù)，分析各弧菌的牙鲆抗血清與抗原組分之間的交叉反應(yīng)。

1.8 抗原芯片構(gòu)建及檢測

將6種弧菌抗原的蛋白濃度分別稀釋至1 mg/mL，使用芯片點(diǎn)樣儀在芯片基片上點(diǎn)樣，使每種弧菌形成一個矩陣。每個矩陣包括4種抗原蛋白及陽性（牙鲆抗淋巴囊腫病毒血清）和陰性（含50 %甘油的PBS 液）對照。按照4×4形式點(diǎn)樣，每種成分設(shè)置4個重復(fù)點(diǎn)，37 ℃固定2 h 后，用PBST將抗原芯片沖洗3次，甩干，冰箱內(nèi)密封保存。

使用抗原芯片進(jìn)行檢測時，首先用3.0% BSA封閉1 h（無菌PBS 配制，37 ℃），洗滌甩干后，依次滴加牙鲆抗血清及HRP 標(biāo)記的IgM 單抗2D8（1：3 000），37 ℃孵育1 h；用PBST 洗3次后，再加TMB 發(fā)色液避光發(fā)色5～20 min，最后使用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，超純水漂洗、晾干，用芯片掃描儀記錄結(jié)果。

1.9 抗原芯片應(yīng)用及驗(yàn)證

取鰻弧菌菌液0.2 mL（1×108cfu/mL）腹腔注射牙鲆，觀察發(fā)病情況；抽取牙鲆尾靜脈血，室溫傾斜放置1 h，離心取上清作為檢測樣品，使用構(gòu)建的抗原芯片進(jìn)行檢測。另外，養(yǎng)殖場送檢的發(fā)病大菱鲆主要癥狀表現(xiàn)為體表潰爛、有腹水等，根據(jù)癥狀初步診斷可能是弧菌感染所致。采集大菱鲆血清，使用抗原芯片進(jìn)行檢測。

將96孔酶標(biāo)板分別包被上述6種弧菌，用ELISA 技術(shù)分析牙鲆血清及大菱鲆血清，以驗(yàn)證抗原芯片的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 弧菌抗原蛋白含量

提取了6種弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白，用Bradford 法測定了蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種弧菌中各抗原蛋白的含量有差異，其中胞外產(chǎn)物中抗原蛋白量最低，哈維氏弧菌最低為1.54 mg/mL（表1）。將抗原蛋白濃度調(diào)整為1 mg/mL 用于抗原芯片制備。

表1 Bradford 法測定的各弧菌抗原蛋白含量 單位：mg/mL

2.2 牙鲆抗弧菌特異性IgM 水平變化

ELISA 結(jié)果（圖1）顯示：牙鲆抗6種弧菌血清IgM 與陰性對照血清光吸收值的P/N，在免疫后第2周開始等于或大于2.1，表明產(chǎn)生了特異性抗體，在第4或5周達(dá)到峰值，均在第4～6周保持較高水平。所以，使用4～6周的牙鲆抗血清用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 牙鲆免疫后血清特異性IgM 水平變化

2.3 弧菌抗原組分的抗原性分析

結(jié)果（圖2）顯示：6種弧菌的牙鲆抗血清與各自的抗原組分均能發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)紫紅色，且各矩陣點(diǎn)顯色清晰，與陽性對照的顯色程度相似，而陰性對照沒有明顯的紫紅色，表明6種弧菌免疫牙鲆后均產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，且各弧菌組分具有良好的抗原性。因此，提取的各弧菌抗原組分可以用于構(gòu)建抗原芯片。

2.4 牙鲆抗血清與弧菌抗原組分的免疫交叉反應(yīng)

牙鲆抗血清與6種弧菌全菌蛋白的免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，各弧菌的牙鲆抗血清與各自的抗原蛋白反應(yīng)最強(qiáng)（圖3-A）。另外，魚腸道弧菌抗血清與溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌的全菌蛋白之間有較明顯交叉反應(yīng)；鰻弧菌抗血清與溶藻弧菌全菌蛋白、溶藻弧菌抗血清與副溶血弧菌全菌蛋白、副溶血弧菌抗血清與溶藻弧菌全菌蛋白之間交叉反應(yīng)較弱；哈維氏弧菌、河流弧菌抗血清與其它弧菌的全菌蛋白之間無交叉反應(yīng)。

圖2 6種弧菌組分的抗原性分析結(jié)果

牙鲆抗血清與6種弧菌OMP 的反應(yīng)結(jié)果（圖3-B）顯示，各弧菌的牙鲆抗血清與各自的OMP反應(yīng)最強(qiáng)。另外，魚腸道弧菌抗血清與哈維氏弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌OMP 之間有較明顯的交叉反應(yīng)；鰻弧菌抗血清與溶藻弧菌、哈維氏弧菌OMP 之間交叉反應(yīng)較弱，而河流弧菌抗血清與鰻弧菌、副溶血弧菌OMP 之間也有微弱反應(yīng)；哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌抗血清與其他弧菌OMP 無交叉反應(yīng)。

牙鲆抗血清與胞外產(chǎn)物的反應(yīng)結(jié)果（圖3-C）顯示，6種弧菌的牙鲆抗血清分別與各自的胞外產(chǎn)物反應(yīng)最強(qiáng)烈。另外，魚腸道弧菌、河流弧菌抗血清與其他菌胞外產(chǎn)物之間有明顯的交叉反應(yīng)，但其他菌抗血清與胞外產(chǎn)物之間無交叉反應(yīng)。

牙鲆抗血清與弧菌鞭毛蛋白反應(yīng)結(jié)果（圖3-D）顯示，6種弧菌的牙鲆抗血清分別與各自的鞭毛蛋白反應(yīng)最強(qiáng)，副溶血弧菌抗血清與魚腸道弧菌、河流弧菌的鞭毛蛋白有較弱反應(yīng)，而哈維氏弧菌、河流弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌抗血清與其它弧菌的鞭毛蛋白無交叉反應(yīng)。

圖3 牙鲆抗血清與抗原組分之間的免疫交叉分析結(jié)果

2.5 抗原芯片檢測結(jié)果判定

將6種弧菌的抗原組分，按照示意圖所示制備抗原微陣列（圖4-A），分別對6種弧菌的牙鲆抗血清進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖4-B）顯示：陽性對照呈現(xiàn)明顯紫色，陰性對照不顯色；各弧菌的牙鲆抗血清與各自抗原點(diǎn)的顏色反應(yīng)與陽性對照類似，所有矩陣點(diǎn)皆為紫色，但是與其他弧菌抗原點(diǎn)不反應(yīng)或者僅部分抗原點(diǎn)反應(yīng)而呈淺紫色。以檢測魚腸道弧菌抗血清為例，滴加魚腸道弧菌抗血清后，魚腸道弧菌矩陣中所有抗原點(diǎn)均顯示紫紅色，顏色與陽性對照點(diǎn)相似（圖4-B-a）；除此之外，溶藻弧菌矩陣中全菌蛋白和外膜蛋白，以及鰻弧菌矩陣的外膜蛋白點(diǎn)與魚腸道弧菌抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)而顯色，而其他抗原點(diǎn)則不顯色。由此，結(jié)合免疫交叉反應(yīng)結(jié)果，確定抗原芯片檢測結(jié)果的判定方法如下：陽性對照點(diǎn)呈紫紅色，陰性對照點(diǎn)呈無色；如果某抗原矩陣中的所有抗原點(diǎn)均呈紫紅色，表明檢測結(jié)果為陽性，若所有抗原點(diǎn)均無色則為陰性；如果某抗原矩陣中僅部分抗原點(diǎn)顯色，則為交叉反應(yīng)；如果陽性對照點(diǎn)為無色，說明抗體活性消失或者檢測操作有問題，結(jié)果為無效。

根據(jù)確定的檢測結(jié)果判定方法和牙鲆抗血清檢測結(jié)果，可知圖4-B-b 檢測樣品中存在鰻弧菌抗體，圖4-B-c 檢測樣品中存在溶藻弧菌抗體，圖4-B-d 檢測樣品中存在副溶血弧菌抗體，圖4-B-e檢測樣品中存在河流弧菌抗體，圖4-B-f 檢測樣品中存在哈維氏弧菌抗體。

圖4 抗原芯片示意圖及其對6種弧菌的牙鲆抗血清的檢測結(jié)果

2.6 抗原芯片在牙鲆和大菱鲆弧菌病診斷中的應(yīng)用

利用制備的抗原芯片檢測牙鲆血清時，鰻弧菌矩陣的所有抗原點(diǎn)皆顯示紫紅色（圖5-A），表明血清中具有鰻弧菌的特異性抗體，即牙鲆被鰻弧菌感染。當(dāng)檢測大菱鲆血清時，抗原芯片上溶藻弧菌矩陣的抗原點(diǎn)全部顯色（圖5-B），可以判定大菱鲆被溶藻弧菌感染。陽性對照矩陣點(diǎn)皆顯示紫紅色，而陰性對照點(diǎn)不顯色。

圖5 抗原芯片檢測患病牙鲆和大菱鲆血清結(jié)果

ELISA 結(jié)果（圖6）顯示：牙鲆血清與鰻弧菌反應(yīng)最強(qiáng)烈，表明牙鲆被鰻弧菌感染；而大菱鲆血清與溶藻弧菌的反應(yīng)最強(qiáng)烈，表明大菱鲆被溶藻弧菌感染。該結(jié)果與抗原芯片檢測結(jié)果一致。

3 討論

圖6 牙鲆和大菱鲆血清ELISA 檢測結(jié)果

細(xì)菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白等抗原組分在其致病過程中皆發(fā)揮重要作用。因細(xì)菌表面抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用會產(chǎn)生特異性抗體，所以針對抗原特異性抗體的檢測常用于病原感染的血清學(xué)診斷、免疫狀態(tài)評價(jià)及流行病學(xué)研究[4]。傳統(tǒng)的免疫學(xué)技術(shù)，如免疫熒光技術(shù)、ELISA 等，一般每次操作只能檢測一種成分，且常常需要對血清進(jìn)行系列稀釋，因而延長了診斷時間，需要的樣品和試劑量也較多[14]。病原菌之間的共同抗原導(dǎo)致的免疫交叉反應(yīng)是免疫學(xué)檢測技術(shù)需要考慮的主要干擾因素。本研究在使用全菌蛋白的同時，使用了外膜蛋白、胞外產(chǎn)物和鞭毛蛋白。它們與其他弧菌抗血清的交叉反應(yīng)相對較弱，尤其是胞外產(chǎn)物和鞭毛蛋白與其他弧菌抗血清幾乎沒有交叉反應(yīng)，能夠保證抗原芯片的部分抗原點(diǎn)與其他弧菌抗血清無反應(yīng)，從而不顯色，有助于排除交叉反應(yīng)的干擾。本研究構(gòu)建的6種弧菌血清學(xué)診斷抗原芯片，在載玻片上很小的區(qū)域內(nèi)，將1種弧菌的多種抗原蛋白排列成矩陣，每種抗原蛋白設(shè)置4個重復(fù)點(diǎn)，并同時設(shè)置陽性和陰性對照點(diǎn)，矩陣內(nèi)所有抗原點(diǎn)同時顯色則為陽性，部分顯色則為交叉反應(yīng)。這種多靶標(biāo)并行檢測的方法有效避免了交叉反應(yīng)對陽性結(jié)果判定的干擾，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，使用很少量的檢測血清樣品及試劑情況下，一次操作可同步完成多種抗原-抗體反應(yīng)。這種高通量檢測模式保證了在不篩選特異性抗原情況下，可以實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)的準(zhǔn)確檢測，因而大大提高了檢測效率，節(jié)約了檢測成本，克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測技術(shù)的不足[3，12]；而使用酶標(biāo)二抗作為檢測抗體，使檢測結(jié)果肉眼可見，也可使用普通照相機(jī)或掃描儀記錄結(jié)果，因而提高了抗原芯片的實(shí)用性。

蛋白芯片通常使用載玻片作為載體，以滿足芯片的高密度、檢測樣品用量少及定量需求。而保存蛋白質(zhì)構(gòu)象以保持其三維結(jié)構(gòu)、功能和結(jié)合位點(diǎn)，對于保持蛋白芯片的穩(wěn)定性以及蛋白間的相互作用皆非常重要[15]。本課題組前期比較了不同載體用于蛋白芯片制備的效果以及不同修飾載體的原子力顯微鏡表征，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖修飾玻片具有均勻的三維多孔結(jié)構(gòu)，有利于抗體的物理吸附及抗原活性的保持[5-6]。因此，本研究采用瓊脂糖修飾玻片作為抗原芯片基片，以更好地保存蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和抗原性[14]。另外，為了保證有足夠的抗原與血清抗體反應(yīng)，本研究設(shè)置了較高濃度的抗原含量（1 μg/mL），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗原矩陣中所有抗原點(diǎn)可以同時顯示相似的紫紅色，與陽性對照點(diǎn)的顏色類似，這有助于準(zhǔn)確區(qū)分陽性結(jié)果和交叉反應(yīng)。

本研究利用制備的診斷抗原芯片，檢測患病牙鲆和大菱鲆血清，發(fā)現(xiàn)鰻弧菌矩陣和溶藻弧菌矩陣的所有抗原點(diǎn)均呈現(xiàn)紫紅色，表明兩種魚的血清中分別含有鰻弧菌和溶藻弧菌的特異性抗體，即分別被鰻弧菌和溶藻弧菌感染，而其他矩陣僅部分抗原點(diǎn)顯示淺紫色，則表示為交叉反應(yīng)，ELISA 檢測結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)果的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)[16]顯示：大菱鲆IgM 基因結(jié)構(gòu)與牙鲆很相似，且大菱鲆IgM 單抗與牙鲆IgM 有一定程度的交叉反應(yīng)[17]。本研究使用HRP 標(biāo)記的牙鲆IgM 單抗作為檢測抗體，可同時與牙鲆及大菱鲆血清抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，表明構(gòu)建的抗原芯片能夠用于牙鲆和大菱鲆弧菌病的血清學(xué)診斷。本課題組前期曾制備了抗大菱鲆[18]、許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[19]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[20]和花鱸（Lateolabrax japonicus）[21]的IgM 單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨IgM 單抗與牙鲆、大菱鲆、花鱸、許氏平鲉等魚類的IgM 不發(fā)生交叉反應(yīng)[19]，而花鱸IgM 單抗與牙鲆、大菱鲆、半滑舌鰨、許氏平鲉等魚類的IgM也無交叉[20]，因此本研究構(gòu)建的抗原芯片在使用牙鲆IgM 單抗作為檢測抗體情況下，不能對所有魚類弧菌病的血清學(xué)診斷。但是，僅需使用其他魚類的IgM 單抗代替牙鲆IgM 單抗作為檢測抗體，該抗原芯片即可應(yīng)用于其他魚類的弧菌病診斷，而且本課題組研制的多種魚類IgM 單抗也為該抗原芯片應(yīng)用于魚類弧菌病的血清學(xué)診斷提供了材料基礎(chǔ)。另外，構(gòu)建的抗原芯片可以準(zhǔn)確檢測6種弧菌的特異性抗體，表明該芯片也可以用于這6種弧菌疫苗的免疫效果評價(jià)。