成偉偉，陳伯祥，常攀峰，楊 明，趙子惠

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

羊傳染性膿皰是由羊傳染性膿皰病毒（ORFV）感染山羊和綿羊，在其嘴唇部皮膚形成膿皰或結(jié)成厚痂的一種人獸共患傳染病[1]。該病主要在3月齡左右的羔羊和部分免疫力下降的成年羊中流行，可導(dǎo)致感染羔羊死亡、成年羊生產(chǎn)性能下降[2]。該病也可感染人，使人的手部皮膚出現(xiàn)潰瘍甚至壞死[3-4]。因而該病既影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展，也威脅人們身體健康。

ORFV 的ORF112基因編碼的CBP 蛋白是趨化因子結(jié)合蛋白，含有286個氨基酸殘基[5]。ORF112基因長約861 bp。CBP 蛋白能夠競爭性地結(jié)合趨化因子，阻止G 蛋白偶聯(lián)受體與趨化因子結(jié)合，從而抑制宿主的免疫反應(yīng)。有研究[6]表明，敲除ORF112基因，對ORFV 的致病性有明顯影響。然而其具體機(jī)制并不清楚，CBP 蛋白是否還具有其他功能也不清楚。所以，本研究以O(shè)RFV NZ2毒株的CBP 蛋白氨基酸序列為研究對象，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對CBP 蛋白的理化特性、親水性、跨膜區(qū)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測分析，以期為CBP 蛋白的功能研究和ORFV 的致病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列

選 取GenBank 中ORFV NZ2毒株的CBP 基因序列（序列號為ABA00630），運(yùn)用Editseq 軟件翻譯成CBP 蛋白的氨基酸序列，序列如下：

1.2 方法

運(yùn)用在線工具ProtParam，分析CBP 蛋白的理化特性[7]；利用DNAstar 軟件中的KyteDolittle方法，預(yù)測CBP 蛋白的親水性和疏水性；利用在線軟件TMHMM 和SingnalIP，預(yù)測CBP 蛋白的跨膜區(qū)和信號肽[8]；利用DNAstar 軟件，預(yù)測分析CBP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)[9-10]；將CBP 蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model，使用RasMol 分析軟件構(gòu)建OVIFNR 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型[11]；運(yùn)用在線ABCpred 工具和DNAstar 軟件，預(yù)測CBP 蛋白B細(xì)胞表位[12-13]，并綜合分析單參數(shù)預(yù)測結(jié)果，篩選出優(yōu)勢B 細(xì)胞表位；分別運(yùn)用在線服務(wù)器nHLAPred 和在線軟件SYFPEITHII，預(yù)測CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三種MHC-I 結(jié)合肽段，并結(jié)合兩種方法預(yù)測出的結(jié)果，篩選出優(yōu)勢CTL 表位[14]；分別使用在線服務(wù)器ProPred 和在線軟件SYFPEITHI，預(yù)測CBP 蛋白所含的HLA-DRB1*0101、HLADRB1*0102、HLA-DRB1*0301三種MHC-II 結(jié)合肽段，然后結(jié)合兩種方法預(yù)測出的結(jié)果，篩選出優(yōu)勢Th 表位[15]。

2 結(jié)果

2.1 CBP 蛋白的理化特性預(yù)測分析

CBP 蛋白的理化特性預(yù)測分析結(jié)果顯示，CBP 蛋白的分子式為C1357H2155N367O451S11，相對分子質(zhì)量為31.179 89 kDa，理論等電點為4.68，半衰期為30 h，穩(wěn)定系數(shù)為43.06，脂肪族指數(shù)為81.78，總平均親水性為-0.383。

2.2 CBP 蛋白的親疏水性預(yù)測分析

CBP 蛋白的親水性和疏水性預(yù)測結(jié)果（圖1）顯示，CBP 為親水性蛋白，其親水性區(qū)域主要位于19～62、71～90、119～125、132～158、165～184、188～220、242～290位氨基酸區(qū)域。

2.3 CBP 蛋白的跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測分析

圖1 CBP 蛋白親水性預(yù)測結(jié)果

CBP 蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果（圖2）顯示，CBP 蛋白無跨膜區(qū)，其1～286個氨基酸殘基全部在膜外。CBP 蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，CBP 蛋白存在潛在的信號肽，位于1～15位氨基酸殘基處，在16～17位處存在剪切位點。

2.4 CBP 蛋白的二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

圖2 CBP 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

圖3 CBP 蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

CBP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖4）顯示：CBP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)中主要包括α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4種類型，所占比重分別為α 螺旋38.11%、β 折疊33.91%、β 轉(zhuǎn)角5.94%、無規(guī)卷曲10.48%；CBP 蛋白的α 螺旋主要位于1～24、27～35、39～48、67～95、155～163、235～245、251～253、260～273，β 折疊主要位于49～57、63～66、96～114、122～131、136～143、151～154、182～189、206～212、217～227、229～234、246～250、276～281，β 轉(zhuǎn)角主要位于58～61、146～148、166～169、175～177、198～200，無規(guī)卷曲主要位 于36～38、117～121、132～134、170～172、178～181、190～195、201～203、282～284。使用在線軟件Swiss-Model 構(gòu)建的CBP 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型如圖5所示。

圖4 CBP 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖5 CBP 蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模

2.5 CBP 蛋白的B 細(xì)胞表位預(yù)測分析

利用DNAstar 軟件對CBP 蛋白的柔性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖6所示；運(yùn)用在線軟件ABCpred 預(yù)測CBP 蛋白B 細(xì)胞表位，結(jié)果如表1所示。將β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性區(qū)域的預(yù)測結(jié)果作為CBP 蛋白B 細(xì)胞表位預(yù)測的參數(shù)，結(jié)合ABCpred 預(yù)測結(jié)果，綜合篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細(xì)胞表位，結(jié)果篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細(xì)胞表位6個，分別是17～27、21～31、74～84、81～91、118～128、132～142（表2）。

2.6 CBP 蛋白的T 細(xì)胞表位預(yù)測分析

圖6 CBP 蛋白的柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性預(yù)測結(jié)果

表1 ABCpred 預(yù)測CBP 蛋白B 細(xì)胞表位

運(yùn)用在線服務(wù)器nHLA-Pred 對CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三種MHC-I 結(jié)合肽段的預(yù)測結(jié)果見表3，利用在線軟件SYFPEITHII 對CBP 蛋白CTL 表位進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果見表4。結(jié)合兩種方法的預(yù)測結(jié)果，篩選出CBP 蛋白的3個優(yōu)勢CTL 表 位，分別為4～13位 的VLLLALLGA、65～74位 的CMLDIEDSV 和120～129位 的SLEDSYLYV。

表2 綜合篩選CBP 蛋白優(yōu)勢B 細(xì)胞表位

使用在線服務(wù)器ProPred 預(yù)測CBP 蛋白HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0102和HLADRB1*0301三種MHC-II 結(jié)合肽段，未預(yù)測出MHC-II 結(jié)合肽段；運(yùn)用在線軟件SYFPEITHI 預(yù)測CBP 蛋白的MHC-II 結(jié)合肽段，也未預(yù)測出MHC-II結(jié)合肽段。兩種預(yù)測的結(jié)果表明，CBP 蛋白可能不含Th 細(xì)胞表位。

表3 nHLA-Pred 方法對CBP 蛋白CTL 表位的預(yù)測結(jié)果

表4 SYFPEITHI 方法對CBP 蛋白CTL 表位預(yù)測

3 討論

通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測出CBP 蛋白的理論等電點為4.68。蛋白質(zhì)所處環(huán)境的pH 大于理論等電點時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，小于理論等電點時，蛋白質(zhì)帶正電[16-17]。而CBP 蛋白在ORFV 感染宿主的早期表達(dá)中，宿主體內(nèi)的pH 約為7.0左右，所以該蛋白在宿主體內(nèi)帶負(fù)電；該蛋白的穩(wěn)定系數(shù)為43.06，說明該蛋白不太穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與其特定的氨基酸序列、剪切加工及空間結(jié)構(gòu)都有密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)是否為親水性蛋白主要取決于其分子表面的電荷量。CBP 蛋白雖為親水性蛋白，但較強(qiáng)的親水性區(qū)域較少，說明該蛋白形成抗原表位方面的能力不足。在線軟件SingnalIP 預(yù)測結(jié)果表明，CBP 蛋白存在潛在的信號肽，有信號肽的蛋白大多被分泌到膜外發(fā)揮作用；而在線軟件TMHMM 預(yù)測結(jié)果表明，CBP 蛋白無跨膜區(qū)，1～286個氨基酸殘基全部在膜外。這兩種預(yù)測結(jié)果充分說明，CBP 蛋白被運(yùn)輸?shù)侥ね獍l(fā)揮作用。

CBP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占比重較小，說明該蛋白不易形成抗原表位；而CBP 蛋白的表位預(yù)測結(jié)果也說明了這一點，CBP 蛋白預(yù)測出的細(xì)胞表位較少。Swiss-Model 是基于同源建模的方法構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，是目前三級結(jié)構(gòu)預(yù)測中最好的預(yù)測工具之一，構(gòu)建出的三級結(jié)構(gòu)具有更高的準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建有助于對蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識。本研究構(gòu)建的CBP蛋白的三維結(jié)構(gòu)形似倒立的啞鈴狀，上下兩部分比較對稱。本研究在CBP 蛋白B 細(xì)胞表位預(yù)測方面，將β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性區(qū)域的預(yù)測結(jié)果作為參數(shù)，并結(jié)合 ABCpred 預(yù)測結(jié)果篩選CBP 蛋白的B 細(xì)胞表位，這樣篩選出的CBP 蛋白B 細(xì)胞表位具有更高的可信度。在CTL 細(xì)胞表位預(yù)測方面，結(jié)合了nHLA-Pred 和SYFPEITHII 兩種方法預(yù)測的結(jié)果，在Th 細(xì)胞表位預(yù)測方面，結(jié)合了ProPred 和SYFPEITHII 兩種方法預(yù)測的結(jié)果，所以預(yù)測出的CBP 蛋白T 細(xì)胞表位具有更高的可靠性。本研究篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細(xì)胞表位6個、CTL 細(xì)胞表位3個，未預(yù)測出Th 細(xì)胞表位。這樣CBP 蛋白較少的細(xì)胞表位與CBP 蛋白二級結(jié)構(gòu)中β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占比重較小相互印證。本研究在B 細(xì)胞表位預(yù)測上與黎攝兒等[18]對ORFV 湖北分離株的CBP 蛋白B 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果基本一致，但在T 細(xì)胞表位預(yù)測上差異較大。這可能與ORFV 各毒株間的差異有關(guān)。CBP 蛋白未預(yù)測出Th 細(xì)胞表位，說明該蛋白可能在ORFV 逃避宿主免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了作用。

本研究僅運(yùn)用生物信息學(xué)方法對ORFV NZ2毒株CBP蛋白的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表位進(jìn)行了分析預(yù)測，因受條件限制，尚未對得到的結(jié)果和結(jié)論進(jìn)行實驗驗證，但該仍可為CBP 蛋白的功能研究與ORFV的致病機(jī)制研究提供一定的參考。