陳麗 周忠志，2 劉沐琳 陳港軍 吉琳 楊樂 岳育民 邢琴

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2第一附屬醫(yī)院)

嚴(yán)重創(chuàng)傷是危害人類健康的重要因素之一〔1～4〕。創(chuàng)傷愈合的以往研究大多與經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Sma和Mad同系物(Smad)通路相關(guān)〔5，6〕。有研究證實(shí)，Ski基因是TGF-β/Smad信號(hào)通路的核內(nèi)負(fù)調(diào)控因子，可雙向調(diào)控TGF-β/Smad依賴和非依賴信號(hào)通路〔7，8〕。復(fù)方ANBP是仙鶴草(A)、藕節(jié)(N)、乳香(B)和蒲黃(P) 治療創(chuàng)傷的經(jīng)驗(yàn)方，用于創(chuàng)傷早期的治療，具有止血消炎、活血生肌的功效〔9〕。復(fù)方ANBP是臨床治療創(chuàng)面的經(jīng)驗(yàn)藥方，有一定的臨床基礎(chǔ)，且有廣泛的促進(jìn)創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方ANBP雙向調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合抑制瘢痕的效果〔9，10〕，但能否啟動(dòng)修復(fù)基因Ski雙向調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究尚缺乏〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠背部全層皮膚缺損模型，觀察創(chuàng)面愈合情況及TGF-β1、Smad2/3、Ski的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討復(fù)方ANBP促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6雌性小鼠48只，7周齡，體質(zhì)量10～20 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑 復(fù)方ANBP由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)買仙鶴草、藕節(jié)、乳香和蒲黃并制備〔13〕，試驗(yàn)全過程使用同種藥物?？筍ki抗體(批號(hào)：ab131134)、抗Smad2/3抗體(批號(hào)：ab217553)、抗TGF-β1抗體(批號(hào)：ab92486)、羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G H&L(批號(hào)：ab6721)均購(gòu)自Abcam公司。

1.3分組及建立動(dòng)物模型 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為ANBP組、空白對(duì)照組各24只。兩組均分別隨機(jī)分為4個(gè)亞組各6只，造模時(shí)腹腔注射10%水合氯醛(5.5 ml/kg)麻醉，將實(shí)驗(yàn)器械均消毒完畢后開始脫毛、備皮、消毒，用直徑1 cm的全層打孔器在小鼠背部制成全層皮膚缺損模型。造模后，空白對(duì)照組不做處理，ANBP組的創(chuàng)面上立即均勻覆蓋上一層中藥復(fù)方ANBP粉末。

1.4標(biāo)本采集 兩組分別于造模后6 h、3 d、7 d、14 d用10%水合氯醛麻醉，對(duì)創(chuàng)面拍照記錄。取相同部位以創(chuàng)面為中心、深至骨組織的大小為2 cm×2 cm標(biāo)本，于4%多聚甲醛的瓶中固定，常溫保存。

1.5免疫組化檢測(cè) ①脫蠟和水化：二甲苯10 min×3次→無水乙醇浸泡3 min×3次→95%乙醇中浸泡3 min×2次→75%乙醇中浸泡3 min×2次→蒸餾水沖洗1 min→置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。②抗原修復(fù)：滴pH6.0枸櫞酸緩沖液于切片上，置微波爐加熱至沸騰，間隔5～10 min×2次，室溫冷卻。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；PBS沖洗3 min×3次。④滴加一抗：滴加100 μl一抗，小鼠單克隆抗體Ski(稀釋濃度1∶100)、兔多克隆抗體Smad2/3(稀釋濃度1∶50)、兔多克隆抗體TGF-β1(稀釋濃度1∶100)，37℃孵育60 min：PBS沖洗3 min×3次。⑤滴加反應(yīng)增強(qiáng)液：滴加100 μl反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min；PBS沖洗3 min×3次。⑥滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物：滴加100 μl增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20 min；PBS沖洗3 min×3次。⑦顯色：加入適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，室溫孵育6 min。⑧復(fù)染：自來水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s；分化、沖洗返藍(lán)。⑨脫水、透明、封片。

1.6平均光密度值計(jì)算 顯微鏡下觀察皮膚組織中的Ski、Smad2/3、TGF-β1蛋白在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，顯示棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡下視野，采用MOTIC6.0圖像分析軟件分析陽性染色的光密度值，取平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)方ANBP對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的雙向調(diào)節(jié) TGF-β1陽性表達(dá)部位在成纖維細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中，棕黃色顆粒為陽性表達(dá)；Smad2/3蛋白表達(dá)于成纖維細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中，棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。造模后6 h，空白對(duì)照組可見少量成纖維細(xì)胞，膠原稀疏，少量陽性顆粒，著色淺且面積小，表達(dá)量少；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，膠原增多，陽性顆粒增多，表達(dá)量增加。造模后3 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，膠原增多，陽性顆粒增多，表達(dá)量增加；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，膠原更致密，陽性顆粒增加明顯，表達(dá)量明顯增多。造模后7 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，膠原更致密，陽性顆粒增加明顯，表達(dá)量明顯增多；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原疏松，陽性顆粒明顯減少，表達(dá)量降低。造模后14 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原含量降低，陽性顆粒減少，表達(dá)量降低；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，膠原更疏松，陽性顆粒明顯減少，表達(dá)量明顯降低，見圖1。

圖1 造模后各時(shí)間點(diǎn)兩組背部創(chuàng)面組織TGF-β1及Smad2/3的表達(dá)(蘇木素染色，×400)

2.2復(fù)方ANBP對(duì)Ski蛋白表達(dá)的影響 Ski陽性表達(dá)部位在成纖維細(xì)胞胞核中，棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。造模后6 h，空白對(duì)照組可見成纖維細(xì)胞，較多陽性顆粒，著色較深且面積較大，表達(dá)量較多；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，膠原較少，陽性顆粒少，表達(dá)量減少。造模后3 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，膠原更致密，陽性顆粒增加明顯，表達(dá)量明顯增多；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞、膠原增多，陽性顆粒增多，表達(dá)量增加。造模后7 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原疏松，陽性顆粒明顯減少，表達(dá)量降低；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增多，膠原致密，陽性顆粒明顯增加，表達(dá)量增加。造模后14 d，空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞、膠原減少，陽性顆粒減少，表達(dá)量降低；與空白對(duì)照組相比，ANBP組成纖維細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增加，膠原更致密，陽性顆粒持續(xù)增多，表達(dá)量明顯增加，見圖2。

圖2 造模后各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織Ski的表達(dá)(蘇木素染色，×400)

2.3TGF-β1、Smad2/3、Ski在造模后6 h、3 d、7 d、14 d平均光密度值比較 TGF-β1和Smad2/3蛋白免疫組化結(jié)果均顯示，空白對(duì)照組從造模后6 h至7 d表達(dá)量逐漸增高，造模后7 d達(dá)到峰值，造模后14 d雖有所降低，但仍較高；而ANBP組從6 h至3 d表達(dá)量逐漸增高，造模后3 d達(dá)到峰值，造模后7～14 d逐漸降低；造模后3 d，ANBP組的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，造模后7～14 d，ANBP組的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組從造模后6 h至3 d Ski表達(dá)量逐漸增高，造模后3 d達(dá)到峰值，造模后7～14 d逐漸降低；而ANBP組從6 h至14 d表達(dá)量逐漸增高，造模后14 d達(dá)到峰值；造模后6 h至3 d，ANBP組Ski的表達(dá)量均低于空白對(duì)照組(P<0.05)，造模后7～14 d，ANBP組Ski表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 TGF-β1、Smad2/3、Ski在兩組造模后各時(shí)間點(diǎn)平均光密度值

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

3 討 論

創(chuàng)面修復(fù)的過程是一個(gè)多因素、多因子參與的復(fù)雜過程〔13～15〕。TGF-β/Smad通路與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)，TGF-β和Smads蛋白分別是成纖維細(xì)胞的趨化因子和下游信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，該通路可以直接或間接作用于炎癥及修復(fù)細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)面愈合〔16，17〕。研究證實(shí)，復(fù)方ANBP是通過雙向調(diào)節(jié)兔耳增生性瘢痕模型中TGF-β/Smad通路減輕炎癥、促進(jìn)肉芽形成，加速再表皮化達(dá)到促愈抑瘢療效〔10〕。本研究結(jié)果說明ANBP在創(chuàng)傷早期促進(jìn)真皮層TGF-β1和Smad2/3蛋白的表達(dá)，在造模后期明顯降低其表達(dá)，可雙向調(diào)節(jié)小鼠背部全層皮膚缺損模型TGF-β/Smad信號(hào)通路。

有研究證實(shí)，Ski是創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵基因，同時(shí)是TGF-β/Smad信號(hào)通路的核內(nèi)負(fù)調(diào)控因子，可雙向調(diào)控TGF-β/Smad依賴和非依賴信號(hào)通路〔18～20〕。說明復(fù)方ANBP在創(chuàng)傷早期通過啟動(dòng)創(chuàng)傷關(guān)鍵修復(fù)基因Ski，雙向調(diào)節(jié)真皮層TGF-β1和Smad2/3蛋白的表達(dá)，達(dá)到減輕創(chuàng)傷早期損傷和炎癥反應(yīng)，加快肉芽組織增生和再表皮化速度，加速創(chuàng)傷愈合的進(jìn)程，提高創(chuàng)傷愈合質(zhì)量，但復(fù)方ANBP對(duì)全層皮膚缺損小鼠愈合的分子機(jī)制仍有待深入研究。